Штамм гибридных культивируемых клеток mus мusсulusl, используемый для получения моноклональных антител к рекомбинантному @ - фактору некроза опухолей человека

 

союз сОВетских социАлистических

РЕСПУБЛИК (я)з С 12 N 5/00, С 12 P 21/08

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4914619/13

- (22) 28,01.91 (46) 15.07.92. Бюл. ¹ 26 (71) Белорусский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови и Всесоюзный гематологический научный . центр (72) Е,А.Шидловская, А.B. Панютич, Л.А.Лях, Н.В.Петевка, H.Н.Войтенок, Н,И,Мисуно. и

Т, С. Колесникова (56) Авторское свидетельство СССР

¹ 1507791, кл, А 61 К 39/395, 1987.

Авторское свидетельство СССР № 1530638, кл. А 61 К 39/395, 1987.

Авторское свидетельство СССР

¹ 1521776, кл. А 61 К 39/395, 1987. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ KYflbTNIBL4PYЕМЫХ КЛЕТОК MUS MUSCULUS 1., ИС ПОЛЬЗУЕМЫЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ

МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К РЕКОМИзобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в процессе генно-инженерного производства и а-фактора некроза опухолей человека (a-ФНО), а также для определения и нейтрализации аФНО в исследовательской работе.

Известны гибридные штаммы, продуцирующие моноклональные антитела к QФНО человека.

Однако нейтрализующая активность антител, как правило, невысока, Прототипом служит штамм 3C7N, который не обладает достаточной продуктичностью.

Целью изобретения является получение более продуктивного гибридного штамма, используемого для производства монокло„„5U„„1747484 А1

Б IHAHTHOIVIY а -ФАКТОРУ НЕКРОЗА

ОПУХОЛЕЙ ЧЕЛОВЕКА (57) Использование: биотехнология, выделение, очистка, а также нейтрализация биологической активности рекомбинантного а-фактора некроза опухолей человека (раФНО). Сущность изобретения . получение штамма гибридных культивируемых клеток

Mus musculus L., продуцирующего моноклональные антитела (MKA) повышенной специфичности и нейтрализующей активности по отношению к р а-ФНО. Штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии

BaIb/с с клетками мышиной миеломы Х63Ag8-653, МКА относятся к lgG2a, их концентрация в культуральной .жидкости составляет 100-125 мкг/мл, в асцитной жидкости 7-8 мгlмл. Удельная нейтрализующая активность МКА (выраженная в МЕ р аФ НО, нейтрализуемых 1 мкг IgG) составляет

5000. 4 табл. нальных антител к рекомбинантному аФНО человека. Моноклональные антитела (МКА) отличаются высокой нейтрализующей активностью, Штамм получают следующим образом, ©©

Мышей линии Balb/с иммунизируют 4Ъ внутрибрюшинно5 мкг рекомбинантногоаФНО (р а -ФНО) человека. разведенного

0,15 M Nagl, в смеси с равным объемом, @ полного адьюванта Фрейнда. Реиммунизацию проводят через 7 недель 10 мкг раФНО в изотоническом растворе за 3 дня до слияния. Гибридизацию 1,2к10 клеток селе8 .зенки иммунных мышей и 4х10 клеток мие7 ломы мыши Х63-Ag8-653 проводят 50 -ным раствором полизтиленгликоля мол.массы

4000, содержащего 5 / диметилсульфокси1747484 да, в течение 1,5 мин. После гибридизации и отмывания клеток от полиэтиленгликоля, клетки высевают в 96-луночные панели по 1»

«10 спленоцитов в лунку. Для культивирования и селекции гибридом используют среду 5

IMDM (модифицированная Iskove s среда

Дульбекко) с добавлением 10% эмбриональной телячьй сыворотки (ЭТС), 10 М

-4 гипоксантина, 4 10 М аминоптерина и 1,6«

«10 М тимидина. Гибриды-продуценты кло- 10 нируют один раз методом конечных разведений, высевая по 1 клетке на лунку, содержащую 4 10 клеток селезенки, После

4 клонирования практически 100% субклонов продуцируют MKA к ра -ФНО. Продукция 15 антител сохраняется как минимум в течение

15 пассажей в культуре. Штамм получил условное обозначение 10FN.ÎH хранится в

ЭТС с добавлением 10% диметилсульфоксида в жидком азоте. Штамм продуцирует 20

MKA G2a иэотипа, обладающие специфичностью к a -ФНО человека, Секреция моноклональных антител на 3-4 день культивирования составляет 100-125 мкг/мл культуральной среды, 25

Использование штамма иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1, Гибридные клетки помещают в стеклянный флакон объемом 50 мл по 1>10 клеток в 5 мл среды IMDM с 10% 30

ЭТС, 2мМ 1-глютамина, 100 мкг/мл пенициллина и стрептомицина, 0,05 MM меркаптозтанола, Клетки культивируют 2-3 дня при

37 С в атмосфере 5% С02. МКА выделяют иэ полученного супернатанта аффинной хро- 35 матографией на колонке с иммобилизированным рекомбинантным белком А St.

aureus Cowal1! и используют в иммуноферментном анализе (ИФА), р а-ФНО, рР-ФНО и бычий сывороточный альбумин (БСА) в ко- 40 личестве 0,3 мкг в 100 мкл 0,1 M карбонатного буфера (рН 9,5) вносят в 96-луночные микроплаты и оставляют на ночь при 4 С, о

Отмывают водопроводной водой и вносят 1 мкг MKA в 100 мкл 0,1 М фосфатного буфера 45 (pH 7,4), содержащего 0,15 М NaCI, 1% БСА (ФСБ-БСА); Инкубируют в течение 1 ч на встряхивателе. После отмывания инкубируют с меченными пероксидазой к иммуноглобулинам мыши энтителами в разведении

1:2000 на ФСБ-БСА в течение 1 ч, Ферментную реакцию проводят в течение 10 мин.

Раствор субстрата представляет собой 0,1

М цитратный буфер (рН 4,7) с 0,6 мг/мл ортофенилендиамина гидрохлорида и

0.01% перекиси водорода. Реакцию останавливают через 10 мин 1М серной кислотой и учитывают на спектрофотометре с вертикальным лучом при длине волны 492 нм, Результаты эксперимента по изучению специфичности связывания МКА, продуцируемого клетками штамма 10FN, с антигенами, иммобилизированными на пластике, представлены в табл.1, Результаты исследований свидетельствуют о более высокой специфичности МКА, продуцируемых клетками штамма 10FN по сравнению с прототипом, и подтверждают возможность применения данных МКА для определения ра-ФНО человека с помощью иммуноферментного анализа.

Пример 2. Меченные биотином MKA используют в конкурентном И ФА с адсорбированным на твердой фазе р а-ФНО человека в присутствии двух концентраций немеченных антител.

На 96-луночной полистироловой плате для ИФА адсорбируют ра-ФНО (2 мкг/мл) в 100 мкл 0,1М бикарбонатного буфера (рН

9,5) в течение ночи при+4 С. Неспецифическое связывание блокируют раствором

ФСБ-БСА. После каждой инкубации плату пятикратно отмывают ФСБ, содержащим

0,01% Твина 20. Разведенные раствором

ФСБ-БСА биотинированные MKA смешивают с различными. концентрациями немеченных антител. Смесь добавляют в лунки и инкубируют в течение 1 ч при комнатной температуре на встряхивателе, После отмывания добавляют конъюгированную с авидином пероксидазу (разведение 1:2000 на

ФСБ-БСА) и инкубируют в течение 1 ч, Затем плату отмывают и проводят ферментную реакцию в течение 10 мин, как указано, Результаты исследований представлены в табл.2.

Результаты, представленные в табл.2, свидетельствуют о том, что МКА 10FN в некоторой степени подавляют связывание

MKA 3C7N с р а-ФНО человека, адсорбированным на пластике, и не препятствуют взаимодействию с антигеном МКА АО, Таким образом, MKA штамма 10РИ и 3C7N распознают неидентичные, частично перекрывающиеся эпитопы. Эпитопы, распознаваемые

МКА 10FN и АО, различны, Пример 3. Биологическую активность различных образцов ФНО определяют по лиэису клеток мышиной фибробластоидной линии L929 в присутствии актиномицина D.

Накануне теста клетки L929 рассевают по

50л10 на лунку в плоскодонные 96-луночные микроплаты в минимальной среде, модифицированной Дульбекко (ДМЕМ) с 5%

ЭТС, глютамином, пенициллином и стрептомицином. В отдельной плате готовят разве1747484

Таблица 1

Таблица 2

АО

1 10

ЗС7К

1 10

10FN

1 10

Конкурирующие МКА мкг/мл

Меченные биотином

MKA 10FN (g связывания

110 105

15 01

5 дения образцов ФНО в объеме 50 мкл, вносят равный объем соответствующего разведения антител и инкубируют 30 мин при комнатной температуре. После инкубации образцы переносят в плату с клетками L929, добавляют актиномицин О до концентрации

1 мкг/мл и помещают в термостат с температурой 37 С на 20 ч. Результаты учитывают после окрашивания клеток 0;2 g,-ным раствором генцианвиолета в 20 g,-ном метаноле в течение 15 мин, Оптическую плотность лунок измеряют при длине волны 540 нм на спектрофотометре с вертикальным лучом.

Снижение оптической плотности лунок соответствовало лизису клеток L929. За единицу биологической активности образцов

ФНО принимают то их разведение, которое вызывает 507-ный лизис клеток по отношению к интактным, Результаты эксперимента по нейтрализации биологической активности р а-ФНО человека MKA штаммов 10FN, ЗС7И и АО представлены в табл.3.

Данные табл.3 свидетельствуют о том, что МКА полученного штамма 10FN обладают наиболее высокой нейтрализующей активностьюю.

Крометого, MKA10FN нейтрализуютбиологическую активность как рекомбинантного, так и природного а-ФНО человека (табл.4). Макрофагальный а-ФНО получен

5 нами при стимуляции моноцитов человека

St. aureus до конечной концентрации в культуральной среде 0,001 (по объему) в течение 18ч при 37 С.

Данные этого примера свидетельству10 ют о равной степени эффективности нейтрализации биологической активности как рекомбинантного, так и природного а-ФНО человека, Таким образом, предлагаемый штамм

15 продуцирует МКА к р а-ФНО человека в больших количествах по сравнению с известным. Полученные МКА обладают высокой . нейтрализующей активностью и могут быть использованы для изучения антигенной

20 структуры и биологических эффектов

ФНО человека in vitio u in vivo, а также в процессе генно-инженерного производства а-ФНО.

Формула изобретения

25 . Штамм гибридных культивируемых клеток Mus musculus Е, ВСКК(П) N 441Д, используемый для получения моноклональных антител к рекомбинантному а -фактору некроза опухолей человека, 1747484

Таблица 3

*)-выражена в МЕ р а-ФНО человека, нейтрализуемых 1 мкг Jq G

Таблица 4

*)-активность макрофагального а-ФНО человека составляет 235 МЕ/мл

*+) концентрация р-а-ФНО человека составляет 10нг/мл, что соответствует 750 М Е/мл

Составитель Л.Лях

Техред М.Моргентал

Корректор M.Äåè÷èê

Редактор С.Лисина

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 2473 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5