Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l. - продуцент моноклональных антител к бактериям рода brucella

 

Использование: биотехнология, ветеринария , медицина. Сущность изобретения: штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Balb/c с клетками миеломы Х63-Ад 8-653. Продуктивность штамма достигает 35-45 мкг/мл в культуральной жидкости и 7-8 мг/мл в асцитной. Моноклональные антитела (МКА) направлены к белку внешней мембраны бактерий рода Bruceila смол.м. 14 кД. МКА относятся к классу lgG1. Штамм обозначен СзН4 и хранится под номером ВСКК(П) 518Д. 2 табл.

СОК)3 СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 М 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ CKHT СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ ., I

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4882330/13 (22) 16,11.90 (46) 07.08,92,Бюл. N 29 (71) Целиноградский сельскохозяйственный институт (72) А.К.Булашев, С,З.Ескендирова, А,Ф.Дмитриев, C.Н.Боровиков и К,Г;Шенжанов (56) Авторское свидетельство СССР

N. 1604848, кл. С 12 N 5/00, 30.12,88.

Авторское свидетельство СССР

N. 1604849, кл. С 12 N 5/00, 30,12.88. (54) ШТАММ ГИБРИДН ЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛETÎK ЖИВОТНЫХ MUS MUSИзобретение относится к биотехнологии, а именно к гибридомной технологии, касается получения моноклональных антител (MKA) к антигенам бактерии рода Brucella и может быть использовано в ветеринарии и медицине при разработке средств диагностики и профилактики бруцеллеза, Известны штаммы гибридных клеток (гибридом), вырабатывающие МКА к О-цепи липополисахарида (ЛПС) бруцелл, которые является хорошо изученным антигеном грамотрицательных бактерий.

Имеются также штаммы гибридом продуцентов MKA против»кор" участка полисахаридной молекулы бруцелл.

Получен также штамм, МКАкоторогопоэволяют дифференцировать Brucella от

YersInia entегоcolitica 0:9, Антигенные свойства белков внешней мембран ы (Б В М) В ru cell a начали изучаться сравнительно недавно. Имеющиеся данные свидетельствуют об иммуногенности БВМ и

Ы2, 1752764 А1

CULUS L. —. ПРОДУЦЕНТ МОНОКЛОНАЛЬНЫХ АНТИТЕЛ К БАКТЕРИЯМ, РОДА

BRUCELLA (57) Использование: биотехнология, ветеринария, медицина. Сущность изобретения: штамм получают гибридизацией спленоцитов мышей линии Ва!Ь/с с клетками миеломы Х63-Ag 8 — 653. Продуктивность штамма достигает 35-45 мкг/мл в культуральной жидкости и 7-8 мг/мл в асцитной. оноклональные антитела (МКА) направлены к белку внешней мембраны бактерий рода Brucella с мол. м. 14 кД. МКА относятся к классу lgG1, Штамм обозначен 1СзНа и хранится под номером В СКК(П) 518Д. 2 табл. возможности испольэованияих вкачестве протективного антигена в создании вакцин.

Перспективность белковых антигенов в конструировании вакцинных препаратов обьясняется тем, что они могут быть легче синтезированы или получены методом рекомбинантной. ДНК (генетической инженерии) в достаточном количестве, чем компоненты ЛПС.

Кроме того. установлено, что за перекрестные реакции, отмечаемые между

Brucella и другими микроорганизмами, ответственны не белковые. а полисахаридные антигены. МКА, направленные к белковым антигенам бруцелл, особенно к БВМ, могут быть незаменимым "инструментами" в разработке как диагносТических, так и профилактических препаратов.

Известны клоны гибридных клеток

Bruce 5 и Bruce 6. вырабатывающие МКА к белкам клеточной стенки Brucella. Гибридомы были получены путем слияния сплено1752764 цитов мышей BALB/ñ, иммунизированных инактивированными клетками ВгисеИа

abortus с миеломной линией NC-1. МКА этих гибридом реагировали с ультразвуковым дезинтегратом клеток, но не свяэыва- 5 лись с ЛПС и не обладали способностью агглютинировать бруцелл. Это свойство дает основание отнести МКА Bruce 5 и Bruce

6 к белокспецифическим антителам.

Известна гибридома — А23, продуциру- 10 ющая МКА к БВМ Brucella. МКА клона А23 взаимодействовали с интактными клетками в твердофазном иммуноферментном анализе (ТИФА), но не проявляли активность по отношению к ЛПС. На основании этих дан- 15 ных можно сделать вывод, что данный клон продуцирует МКА, специфичные к эпитопу белка. В приведенных работах не установлена молекулярная масса, антигенность и другие свойства белков, против которых 20 получены МКА, вырабатываемые упомянутыми гибридомами, Целью изобретения является получение штамма гибридных клеток мыши, продуцирующих МКА к БВМ бактерии рода Brucella 25 с м ол, м. 14 КД, Штамм получают следующим образом.

Мышам линии BALB/с в первый день иммунизации внутрибрюшинно вводят 100 мкг БВМ, полученного из Brucella теПтепв1з 30

16М, в 0,1 мл неполного адьюванта Фрейдна. На 7, 11, 12 и 13.й дни иммунизации животным иньецируют по 100 мкг антигена в забуференном физиологическом растворе (ЗФР), рН 7,2-7,4. Спустя 4 дня после по- 35 следней иммунизации извлекают селезенку с тех мышей, которые дают более высокие титры антител по ТИФА, Клетки селезенки иммунных мышей в количестве 20х10 гибридизуют с 2х10 клетками миеломы Х63- 40

Ag8-5.6.3 в присутствии 1 мл раствора, содержащего 45 (объем на объем) полиэтиленгликоля с мол. м. 4000 и 107 диметилсульфооксида в течение 1 мин. После гибридизации и отмывки клеток от полизти- 45 ленгликоля их высевают в ячейки 96-луночной панели.

Селекцию гибридных клеток проводят на среде, содержащей гипоксантин-аминоптерин-,тимидин.. Гибриды-продуценты 50 клонируют два раза методом лимитирующих разведений, высевая в ячейки 96-луночной панели с питающим слоем перитонеальных макрофатов мыши. После второго клонирования практически 100 субклонов 55 продуцируют антитела к тестируемому ан тигену . Продуктивный клон гибридомы обозначают 1 СЗ Н4.

Штамм гибридомы 1 СЗ Н4 хранится в специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Института цитологии АН СССР под номером

ВСКК(П) 518Д и характеризуется следующими свойствами.

Морфологическая характеристика, Культура состоит из слабоприкрепляющихся к подложке округлых клеток размером с исходную миеломную клетку. Ядро занимает большую часть клетки. Цитоплаэма имеет вид тонкого ободка, Культуральные свойства. Среда культивирования — RPMl-1640 с. 10 фетальной сыворотки теленка, 2х10 М глютамина, -з

1х10 М пирувата натрия, 5х10 M 2-меркаптоэтанола, 1х10 НЕРЕЯ. Культивирование штамма ведут при 37,5 С в атмосфере с

5 COz. Характер роста - стационарная суспензия, Частота пассирования — через 2-3 сут, кратность рассева 1:3-1:4; Посевная концентрация клеток 1-2х10 в 1 мл. Наибольшее число клеток в логарифмической фазе роста 0.5 млн/мл.

При внутрибрюшинной прививке мышам гибридомы образуют опухоль в асцитной форме на 10- l2-й день. Доза клеток при прививке 2х10 клеток, За 7 дней до введе6 ния гибридомы необходимо инъецировать животным пристан — 2, 6, 10, 14-тетраметилпентадекан в дозе 0,5 мл на голову. К мо- -, менту депонирования штамм прошел 5 пассажей на мышах BALB/c.

Продуктивность штамма, На 3-4-й день культивирования гибридомы секреция МКА достигается 35-45 мкг/мл в культуральной среде. В асцитной жидкости концентрация иммуноглобулинов составляет 7--8 мг/мл.

Количество последней от одной мыши 48 мл.

Характеристика полезного продукта.

МКА относятся к классу IgG подкласса 1, Оно специфично к антигенной детерминанте БВМ бруцелл с мол, м, 14 кД. При злект-. рофореэе в полиакриламидном теле в присутствии додециосульфата натрия МКА разделяются на Н и L цепи с мол, м, 60 и

20 КД сооттветственно. Константа связывания 2х10 М, Методы оценки специфичности MKA: непрямой и "сэндвич" варианты ТИФА, иммуноблот.

Контаминация штамма, Контаминатов линии, включая бактерии, грибов, дрожжей и микоплазм не обнаружено, Криоконсервация, К осадку гибридных клеток добавляют фетальной сыворотки теленка и диметилсульфооксида до конечной концентрации 10 . Суспензию клеток разливают в стерильные пластиковые ампулы с завинчивающимися крышками по 1-5 млн. кл., помещают в коробку из пенопласта и

1752764

20

40 табл. 2.

55 ставят на 1 сут в морозильник при -70 С, после чего ампулы переносят в жидкий азот, Условия размораживания. Замороженные клетки штамма вынимают из сосуда с жидким азотом и быстро помещают в водя- 5 ную баню на 37 С, Как только растают последние кусочки льда, суспензию гйбридомы переносят стерильной пипеткой в центрифужную пробирку, содержащую 10 мл холодной бессывороточной среды, отмывают один раэ и засевают в ячейки 24-луночной панели с питающим слоем перитонеальных макрофагов. Выживаемость при размораживании 85 g.

Штамм 1 СЗ Н4 используют следующим образом, Пример 1. Гибридные клетки помещают в пластиковый флакон площадью 25 см по 5 х 10 в 5 мл среды культивирования, инкубируют 3-4 дня при 37,5ОС в атмосфере, содержащей 5 /, СО . Культуральную среду Собирают, центрифугируют 10 мин при 800 g и 4 С с целью отделения клеток надосадочной жидкости — супенатанта, содержащего антитела. При культивировании гибридомы In vivo иммуноглобулиновую фракцию на асцитной жидкости получают высаливанием белков сульфатом аммония

45 Д-ного насыщения с последующим диалиэом против ЗФР (рН 7,2-7,4) при 4ОС в 30 течение ночи, Полученные антителосодержащие материалы (супернатант и очищенную асцитную жидкость) используют как . реагенты для изучения специфичности взаимодействия MKA с тестируемыми антиге". 35 нами, Пример 2. 4ля проведения непрямого варианта ТИФА на полистироловую 96-луночную панель для микротитрования сорбируют интактные клетки микроорганизмов в концентрации 1 х 107 кл/мл или БВМ бруцелл по10мкг/мл в100мкл ЗФР, рН 7,2-7,4 при 4 С в течение ночи. Затем панель отмывают 3 раза ЗФР с 0,05 /о-ным твином-20 (ЗФР-ТВ) и 3 раза ЗФР, готовят в ячейках

° панели двукратные разведения супернатанта (1:2 и выше) и очищенной асцитной жидкости (1:100 и выше) в обьеме 100 мкл

ЗФР-Тв. После инкубации в течение 1,5 ч при 37 С панель отмывают описанным спо- 50 собом и вносят в ячейки антитела кролика против иммуноглобулинов мыши, меченные пероксидаэой. Через 1 ч повторяют процедуру отмывки с целью удаления несаяэанных продуктов реакции, а связавшуюся пероксидаэу, а значит, и антитела против антигена бактерий определяют количественно по расщеплению субстрата -Н202 в присутствии хромогена — ортофенилендиамина, Положительная реакция характеризуется коричневым окрашиванием и просчитыва" ется при 492 нм.

Результаты опыта по определению специфичности MKA в непрямом варианте ТИФА представлены в табл. 1

Как видно из табл, l, MKA штамма 1 С3

Н4 взаимодействуют с БВМ трех использо ванных видов бруцелл. Причем титры МКА против Brucelia abortus шт. 19 и Brucella suls шт. 1330 выше, чем против вида Brucella

melltensls 16М, испольэованногодля иммунизацйи мышей. Следует отметить, что МКА, специфичные к БВМ бруцелл, не реагируют с аналогичным антигеном бактерии Yerslnia

entегоcolltlka 0:9, который, как известно, серологически не отличаются от Brucella, Как следовательно ожидать, испытуемые MKA не связывались с ЛПС бруцелл.

Титры МКА против интактных бактерий были ниже и определялись они только при иссле- . довании асцитной жидкости, что обьясняется малой концентрацией специфического антигена, адсорбированного твердой фазой полистиролового носителя, в случае использования суспензии клеток, Пример 3. На полистироловую 96-луночную панель для микротитрования сорбируют MKA из асцитной жидкости (20 мкг/мл), очищенной высаливанием сульфатом аммония, в 100 мкл бикарбонатного буфера(рН 9,5) при 4 С в течение ночи. Затем панель отмывают по три раза ЗФР-Тв и ЗФР, вносят в ячейки БВМ бруцелл в концентрации 5 мкг/мл в ЗФР-Тв и инкубируют1,5ч при 37 С, Панель отмывают описанным способом, готовят в. ячейках двукратные разведения биофабричной позитивной бруцеллезной сыворотки крупного рогатого скота, имеющей титр в реакции агглютинации 1:600, в ЗФР-Тв (1:100 и выше). В качестве отрицательного контроля использовали негативную сыворотку этого же вида животного. После выдерживания панели при 37 С в течение 1,5 ч повторяют процедуру отмывки и в ячейки вносят антивидовые антитела, меченные пероксидазой. Концентрацию связавшихся антител определяют по примеру 2.

Результаты исследований. приведены в

Приведенные данные свидетельствуют не только о специфичности МКА, но и антигенности белков "захваченных" антителами штамма 1 СЗ Н4, а также возможности использования этой тест-системы в разработке методов диагностики бруцеллеза.

Пример 4. Постановка иммуноблота

Образцы БВМ различных видов бруцелл в количестве 10 мкг подвергают электрофорезу в 10 >-ном полиакриламидом геле в присутствии додецилсульфата натрия.

1752764

Таблица 1

Виды бактериальных антигенов

Тит ы МКА в асцитной жидкости в культуральной с eå

1:32

1:16

РО

1:6400

1 800

1:3200

РО

PO

PO

PO

PO

PO

РС1

PO .

1:800

1:400

1:400

1:400

PO

PO

П р и м е ч а н и е, PO — реакция отрицательная.

Таблица 2

П р и м е ч а н и е. Показатель экстинции негативной сыворотки был равен 0,048.

Составитель Г. борискина

Техред M.Моргентал Корректор Л. Лукач

Редактор В. Петраш

Заказ 2733 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж 35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул. Гагарина, 101

Злектрофореграмму переносят на нитроцеллюлоэную бумагу в течение 1 ч при 60 В и 250 мА. Свободные участки носителя блокируют 1 -ным бычьим сывороточным альбумином в ЗФР, рН 7,2-7,4 (18 ч при 4 С), 5 затем отмывают по три раза ЗФР и инкубируег 1,5 ч при 37 С с MKA иэ очищенной асцитной жидкости, разведенной 1:100, 3 Ф Р-Тв. После этого носитель отмывают три раза ЗФР-Тв и ЗФР, затем его выдер- 10 живают в рабочем разведении антимышиных антител, меченных пероксидаэой (1 ч при 37 С). Повторяют процедуру отмывки и проявляют реакцию с помощью 4-хлор-1нафтола. 15

БВМ ВгосеИа abortus шт.19

БВМ ВгцсеИа melitensls шт. 16М

БВM Вrucella suls шт,1330

БВМ Yerslnla entегоcolltica О:9

Л П С B rucella а Ьопцз шт. 19

Интактные клетки:

Brucella abortus шт.19

В ruce Па mel iten s is шт. 498

Brucella suls шт. 1000

Brucella ovls шт. 428

Yersinla емегосоИс!са 0:9

Escherihla coll

Cam lobacter fetus veneralls

При электрофореэе БВМ Brucella

abortus шт, 19, Brucella melltensls шт, 16М и

565, Brucella suls шт. 1330 разделяли на 4 фракции с мол. м. 48; 41-43, 23; 14 кД, Иммунохимическое выявление специфического белка, выполненное по примеру 4, показало, что МКА, продуцируемые штаммом гибридомы 1 СЗ Н4, направлены против детерминанты бВМ с мол. м, 14 кД.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых клеток животных Mus musculus L. ВСКК (П)

518Д, используемый для получения моноклональных антител к белку внешней мембраны бактерий рода Brucella с мол, м. 14 кД.