Штамм гибридных культивируемых клеток животных mus мusсulus l., продуцирующий моноклональные антитела к 146 s- компоненту вируса ящура а @ (алье)

 

Использование биотехнология, вирусология , иммунология Сущность изобретения: штамм получен путем слияния клеток миеломы мыши линии РА с клетками селезенки мыши линии BAIB/C, предварительно иммунизированной 146 S-компонентом культурального вируса Ав(Алье}. На средах для клеточных культур млекопитающих

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 5/00

ГОСУДАРСТВЕННЫИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4898577/13 (22) 02.01,91 (46) 30,07.92. Бюл, й. 28 (71) Всесоюзный научно-исследовательский ящурный институт (72) Л.А,Глобенко, А.Н,Бурдов, В.Н,Иванющенков, Г.А.Худяков, Н.Л.Давыдова.

С. P Кирюхин, С. Г, Баранов, А.И.Молчанова, Г.И. Кожаева и В, К, Спирин . (53) 578,085.23(088,8) (56) Yavin L. et at„ ln: OIE Vl Conf, Comm, pour Гetude FIevre Aphteuse. Paris, 1982, р, 291 — 292, р, 377 — 381.

Saiz l.Ñ. et al., I,Virus Reserch, 1989, 13, р, 45-60. (54) ШТАММ ГИБРИДНЫХ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ КЛЕТОК ЖИВОТНЫХ

MUSMUSCULUS L, П РОДУЦИ РУ10ЩИЙ

MOHOKROHARbHblE АНТИТЕЛА К 146 S- .

- КОМПОНЕНТУ ВИРУСА ЯЩУРА As (АЛЬЕ) Изобретение относится к биотехнологии, в частности гибридомной технологии, и представляет собой новый штамм гибридных клеток, продуцирующих в клеточных культурах и асцитических жидкостях моноклональные антитела (МАт) к вирусу ящура

А5(Алье), используемые в вирусологии и иммунологии для научных исследований и для получения диагчостических. лечебных и профилактических препаратов против я цура, Наиболее близкими к предлагаемому являются штаммы гибридных культивируемых клеток Musmusculus „продуцирующие

МАт к вирусу ящура А5-вакцина, А5 Парма, А5

Вестервальд (AsW) и А5.Испания-86.

МАт к 146S компоненту вируса ящура

6Б-вакцина изучены в ИФА. РИА и реакции

„„БЫ „1751202 А1 (57) Использование: биотехнология, вирусология, иммунология. Сущность изобретения; штамм получен путем слияния клеток миеломы мыши линии PAI с клетками сепезенки мыши линии BAIB/С, предварительно иммунизированной 146 S-компонентом купьтурального вируса А5(Алье), На средах для клеточных культур млекопитающих (! МДМ и ДМЕМ) при температуре 37 С гибридома выделяет в культуральную жидкость моноклональные антигела (IVIKA) к вирусу ящура А5(Алье). В культуральной среде титр антител, определяемый в непрямом ИФА, равен 10 -10 . Введенная в брюшную полость мышей линии BAIB/С гибридома индуцирует образование асцитической жидкости, содержащей МКА с титром в ИФА i0 — 10 . МКА специфичны к гомологиче-4 -5 скому антигену А5(Алье) и неактивны в отношении гетерологичных антигенов (Oi, С и

Азия-I). 1табп.

i нетрализации (PH) на культуре клеток и мышах. Установлено; что МАт, идентифицированные в ИФА и РИА, не активны в PCK. однако некоторые из Них обладали вируснейтрализующими свойствами, В ИФА МАт активны в отношении гомологичного вируса и не реагировали с гетерологичными (01 и

С ) антигенами. Полученные МАт полезны в изучении серопогического родства среди различных штаммов вируса при зпизоотологических исследованиях и для контроля качества реагентов в . производстве вакцины.

Изучение МАт к вирусу ящура Ав Парма проводили в конкурентном анализе со 146S и 12 S частицами. Кроме того, 146S антиген был обработан трипсином и хемотрипсином.

1751202

30

Работая с МАт, полученными на вирус

AgW, установлен широкий спектр специфичности антител в отношении вариантов вируса типа А, но они отличались активностью в зависимости от штамма. МАт к вирусу А В/ в PH были неактивны в отношении вируса

01 и.С, но нейтрализовали изоляты, содержащие антиген А (3).

Изучены свойства МАт, полученные на

146S антиген вируса ящура А Испания-86 в иммунохимических и серологических реакциях, МАт высокоактивны и специфичны в

РИА и неактивны в PH.

Проведенные исследования позволили разделить полученные МАт на 5 групп, которые по разному реагировали с компонентами вируса ящура, в том числе и после обработки ферментами, МАт, обладающие различным спектром характеристик, могут быть использованы для составления панели антител. Однако

МАт, полученные на вирус А; Парма, AsW, А Испания-86, не являются идентичными антителам, полученным на As (Алье), и отличаются по активности в иммунологических реакциях PH и реакции защиты (P3).

Вирус ящура Аь (Ал ье) я вляется производственным при изготовлении диагностических препаратов и вакцин в странах

Восточной Европы. МАт к 1465 компоненту вируса ящура Аз (Алье) в СССР и за рубежом в продаже отсутствуют, Целью изобретения является получение штамма гибридных культивируемых клеток животных Musmusculus ., продуцирующего МАт к l46S компоненту вируса А; (Алье), высоко активных в ИФА и РН, обладающих высокой специфической активностью в

ИФА и PH в отношении А (Алье) и А7 и не активных с гетерологичными штаммами вируса ящура Ал. А12, Аю, О, С1. Азия-1.

Поставленная цель достигнута получением нового штамма гибридных культивируемых клеток животных Musmusculus L, ВСКК (П) 476Д, продуцирующего моноклональные антитела к 146S компоненту вируса ящура Ag (Алье), Моноклонрльные антителэ, полученные из предлагаемого штамма гомогенны. Титр этих антител постоянен, специфичность высокая. Гибридные клетки можно выращивать в желаемых объемах.

Полученные МАт против вируса ящура

А (Алье) реагировали в ИФА со 146S антигеном вируса А (Алье) и А7, что говорит о его высоком антигенном родстве и высокой специфичностй, Аналогичные результаты получены в PH и Р3 на мышатах-сосунах.

Предлагаемый штамм под авторским наименованием ¹ 7 ГПЯ А-5-89 депонирован во Всесоюзной коллекции клеточных культур (r. Ленинград) под регистрационным ¹ ВСКК(П) 476Д.

Предлагаемый штамм получен следующим образом.

Мышам линии BAt В/С в возрасте 1,5-2 мес вводили 146S компонент культурального вируса ящурэ А (Алье) в количестве

100 мкг/мышь интрэперитонеально в соотношении 1:1 с полным адьювэнтом Фрейнда. Через 21 день проводили гипериммунизэцию мышей интраперитонеэльно без адьювэнта этим же антигеном в дозе 100 мкг/мышь.

Спустя 3 дня после повторного введения энтигена проводили тестирование сыворотки мышей в ИФА нэ наличие специфических антител, В опыт отбирали доноров с титром антител в сыворотке крови не менее 10 .

Для гибридизации у иммунизированных мышей стерильно брали селезенку и ресуспендировали в 50 мл культуральной среды ДМЕМ без сыворотки. Клетки.миеломы линии РА! в логарифмической фазе роста отмывали в среде ДМЕМ без сыворотки, смешивапи с иммунными клетками селезенки в соотношении 1:1 и осаждали центрифугированием при 1000 об/мин, К осадку по каплям в течение минуты добавляли 50%ный раствор полиэтиленгликоля (ПЭГ) с мол.м, 4000, содержащий 5% диметилсульфоксида (ДМЯО). Клетки остввляли на 3 мин с ПЭГом, Затем добавляли 5 мл среды

ДМЕМ без сыворотки и оставляли на контакт на 3 мин, Полученную суспензию клеток разбавляли средой ДМЕМ, содержащей

20% фетальной сыворотки и гипоксантинэминоптерин-тимидин (ГАТ) в количестве

13,6 мг/л, 0,176 мг/л и 3,78 мг/л соответственно в рабочих концентрациях. Клетки вносили в 96- и 24-луночные пластины фирмы

"Flow Laboratot les" (Великобритания) по

0,2-1 в количестве 100-20 тыс/лунка соответственно, Через 10 дней супернатанты гибридных клонов тестировали на наличие антител в ИФА. Позитивные клоны составляли 5-7% от общего количества гибридных клеток, Эти клоны дважды субклонировали методом лимитирующих разведений. Отобранный стабильный клон с наивысшим титром антител обозначали ¹ 7 ГПЯА5-89 и депонировали во Всесоюзной коллекции клеточных культур (г, Ленинград) под регистрационным № ВСКК(П) 476Д.

Полученный штамм имеет следующие

1 морфологические и культуральные признаки.

Морфологические признаки.

1751202

Клетки круглые, различной величины, Ядра занимают большую часть клетки, Кариология культуры, Кариотип соответствует виду (мышиный), Модальный класс 84 (16 ), 86 (10 ), 5

88 (16 ) хромосом, Модальный класс для родительской миеломной линии PAI-64 хромосомы.

Культуральные признаки.

Штамм растет на средах для культур 10 млекопитающих! МДМ, ДМЕМ, РРМИ640 с добавлением 10-20 эмбриональной бычьей сыворотки и 50 мкг/мл гентамицина. При селекции гибридных клеток добавляют аминоптерин 0,176 мг/л, гипоксантин 15

13,6 мг/л, тимидин 3,78 мг/л. Оптимальная ростовая концентрация клеток 150000 кл/мл, Оптимальная рН среды 6.8-7,4, клетки инкубируют во влажной атмосфере с 5% С02 при 37 С, При посеве единичные клетки в 20 процессе размножения образуют колонии округлой формы с ровными краями, затем колонии сливаются и формируют сплошной монослой, При посевной дозе 150 тыс кл/мл 25 сплошной монослой формируется на 2-3-й день. Клетки обладают хорошей адгезивной способностью, легко снимаются co стенок посуды встряхиванием без применения трипсина или версена. Жизнеспособность 30 клеток поддерживают путем регулярных пересевав на свежую питательную среду. Частота пересева 2-3 раза в неделю.

Кратность рассева 1;2 1:5, Ти", роста — стационарная суспензия. При введении гибри-. 35 дом внутрибрюшинно мышам линии

BALB/С образуется асцитная или твердая опухоли. Перед введением клеток за 5 — 20 дней этим животным вводят внутрибрюшинно по 0,5 мл ангарского масла (ТУ 38- 40

101-84-81). Титр антител в асцитической жидкости в ИФА составляет 10 — 10, От одной мыши получают 3 — 4 мл асцита. Асцит образуется через 14-20 дней.

Консервация клеток, 45

Гибридома заморожена на 20-25 пассажах по 4 — 10 млн клеток в ампуле (объем

1,0-1,5 мл) в криозащитной среде, содержащей 50 культуральной среды, 43 эмбриональной сыворотки и 7 ДМСО. Клетки в 50 криозащитной среде замораживают на программном замораживателе и хранят при196 С в жидком азотс, Оттаивание быстрое на водяной бане при 38"С.

Количество жизнеспособных клеток по- 55 сле размораживания 60-90 /. Как только среда станет жидкой, клетки переносят в конический пластиковый стакан с 50 мл холодной питательной среды и осаждают центрифугированием при 1000 об/мин. Осадок ресуспендируют в 5 мл среды ДМЕМ с 20% фетальной сыворотки и ГАТ и высевают на стеклянный матрас объемом 50 см . Клетки инкубируют при 37 С. Когда колонии клеток заполняют 50-70 площади матраса, отбирают пробу культуральной жидкости для определения титра антител к вирусу ящура с помощью ИФА. Наивысший титр антител отмечен при полном монослое.

Культуральную жидкость можно применять в качестве диагностического препарата, однако для получения более высокого титра антител до 10 гибридные клетки в

5 дозе 1-10 мин!0,5 мл вводят внутрибрюшинно мышам BALB/C, праймированным внутрибрющинно ангарским маслом, Через 14-30 дней после появления у мышей асцитных или твердых опухолей собирают жидкость (3 — 4 мл), клетки осаждают центрифугированием nðè 1000 об/мин в течение 10 мин. Надосадочная жидкость содержит МАт.

Осадок, содержащий гибридные клетки, переводят в культуру или вновь вводят мышам. Для повышения специфичности МАт проводят их очистку и выделяют чистые иммуноглобулины. Иммуноглобулиновуlo фракцию получают путем двукратного осаждения 10 ПЭГ (а) м,м, 6000 (к антителам добавляют равный объем 20 -ного ПЭГ) и центрифугируют при 3500 об/мин в течение

30 мин. Осадок ресуспендируют в уменьшенном количестве фосфатно-буферного раствора (ФБР). Раствор диализируют против ФБР 24 ч при 4 С. Культуральная жидкость содержит 10-20 мкгlмл, а асциты—

20-30 мгlмл специфических иммуноглобулинов, Сведения о контаминантах линии. Бактерии не обнаружены, грибы не обнаружены, микоплазмы не обнаружены.

Пример. Ящурный антиген А5 (Алье) идентифицируют в ИФА с помощью МАт.

Для этого МАт, разведенные в 0,02-малярном карбонатно-бикарбонатном буфере рН

9,5, в количестве 200 мкл на лунку в концентрации 3 — 100 нг/мл вносят в лунку пластин из полистирола для серологических реакций и инкубируют 2 — 14 ч нри температуре 204 С. Раствор антител удаляют и 3-5 раэ промывают лунки ФБР. Затем влунки вносят по

200 мкл испытуемого раствора в Ф БР с 10 эмбриональной сыворотки (антиген готовят путем десятикратных разведений в этом же растворе) Лунки с антигеном и антителами инкубируют 2 ч при 37 С и 3 — 5 раз отмывают в ФБР. Затем в лунки вносят конъюгат (моноклональные антитела, меченые пероксидазой хрена) в рабочем разведении.

Конъюгат разводят на ФБР с 10 эмбрио1751202 иях

РСК н/а н/а н/а ь/а н/а н/а н/а н/а

Составитель Jl. Глобенко

Редактор Н. Швыдкая Техред M.Moðãåíòàë Корректор Т, Палий

Заказ 2664 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Рэушская наб., 4/5

Пройэводственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 нальной бычьей сыворотки до концентрации 1-5 мкг/мл в расчете Hà lg С и инкубируют 1 — 2 ч при комнатной температуре, Затем лунки 35 раз промывают ФБР и в них вносят субстрат, содержащий ортофенилендиамин 0,4 мг/мл в 0,1 М цитрат-фосфатном буфере, рН 5,0 и 0,01 (НгОг. После инкубации при комнатной температуре в течение

1-5 мин проводят учет реакции путем определения оптической плотности раствора на автоматическом 8-канальном фотометре

Fltertebe Multiscan фирмы Рow Laboratortes (Великобритания). Реакцию можно наблюдать и визуально по интенсивности окраски коричневого цвета.

Установлено, что штамм гибридных клеток стабилен как по культуральным и морфологическим признакам, так и по титру специфических антител в ИФА, PH и РЗ.

Активность и специфичность МАт определяли в ИФА, РН, РЗ, РСК и РДСК с помои гетерологичными штаммами вируса ящура.

Данные определения специфической активности асцитической жидкости, содержащей МАт, полученные от штамма ¹

ВСКК(П) 476Д, представлены в таблице.

5 Из приведенных данных видно, что испытуемые МАт в ИФА обладают высокой специфической активностью к гомологичному (As) и близкородственному (Ат) антигену и совсем не активны в отношении вирусов

10 А22, 01 N. 194, С1 № 564 и Азия-1, Аналогичные результаты получены в PH. МАт к вирусу

А5 не обладают комплементсвязывающей активностью в РСК и РДСК, Полученные МАт могут применяться для

15 обнаружения антигенов вируса ящура в

ИФА, РН, Р3, а также для изучения их антигенной структуры.

Формула изобретения

20 Штамм гибридных культивируемых клеток животных Musmusculus 1.. ВСКК(П)

476Д, продуцирующий моноклональные антитела к 146S-компоненту ящура As (Алье).