Штамм дрожжей candida requinii - продуцент алкогольдегидрогеназы

 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается штаммамикроорганизма-продуцента алкогольдегидрогеназы (АДГ). Цель изобретения - получение штамма дрожжей-продуцента АД Г с более высокой и стабильной активностью фермента при росте на среде с этиловым спиртом. Штамм Candida regulnll ЛС-15 получен с использованием традиционных генетико-селекционных приемов и зарегистрирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ АН СССР под номером ВКИ СРх-321Д. Штамм культивируют на синтетической среде с 2.0 об.% этанола при рН 4.5 и температуре 30°С в течение 14 ч. Активность алкогольдегидрогеназы составляет 3,4 ед/мг - что превышает активность тЬго же фермента у известных штаммов Candida regulnll на 50-146%. 1 табл. г Ic

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 1/16, 9/04

ГОСУДАРСТВЕHHblИ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4749570/13 (22) 16.10.89 (46) 15.01.92. Бюл. N. 2 (71) Институт микробиологии АН БССР (72) О.Н.Замбржицкий, С.П.Коваленко и

М.В,Будрис (53) 577.15 (088,8) (56) Авторское свидетельство СССР

М 553283, кл, С 12 N 9/04, 1975.

Коваленко С.П.Замбржицкий О.Н., Ганусевич В.С. Об отборе мутантов микроорганизмов, утилизирующих этиловый спирт.

Микробиология, 1987, с, 159-161, N. 1, (54) ШТАММ ДРОЖЖЕЙ CANDIDA

REGUINII-ПРОДУЦЕНТ АЛКОГОЛЬДЕГИДРОГЕНАЗЫ

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается получения штаммов — продуцентов алкогольдегидрогеназы, применяемой в молекулярной биологии, фармацевтической и медицинской промышленности.

Известны различные микроорганизмы, способные синтезировать алкогольдегидрогеназу. Широко применяются для получения препаратов алкогольдегидрогеназы штамм ы хлебопека рных дрожжей

Saccharomyces cerevIsIae, Искодная удельная активность алкогольдегидрогеназы (АДГ) клеток этих штаммов составляет 0,110,76 ед/мг.

Наиболее близкими по достигаемому положительному эффекту являются штаммы

Candlda reguinii 316 и Can dida regulnl-232, находящиеся в музее культур Института микробиологии АН БССР. образующие ал„„50„„1705338 А1 (57) Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается штам- ма микроорганизма-продуцента алкогольдегидрогеназы (АДГ). Цель изобретения — получение штамма дрожжей-продуцента АДГ с более высокой и стабильной активностью фермента при росте на среде с этиловым спиртом, Штамм Candlda regulnll

ЛС-15 получен с использованием традиционных генетико-селекционных приемов и зарегистрирован во Всесоюзной коллекции микроорганизмов ИБФМ АН СССР под номером ВКИ CR-321Д. Штамм культивируют на синтетической среде с 2,0 об.ф, этанола при рН 4,5 и температуре 30 С в течение 14 ч. Активность алкогольдегидрогеназы со, ставляет 3.4 ед/мг — что превышает активность трго же фермента у известных штаммов Candlda regulnil на 50-146, 1 табл. когольдегидрогенаэу с удельной активностью 1.38 и 2,27 ед/мг соответственно.

Однако известные штаммы обладают сравнительно низким уровнем активности

АДГ.

Целью изобретения является получение штамма — продуцента АДГ с более высокой и стабильной активностью фермента при росте на среде с этиловым спиртом.

Штамм Candlda regulnll ЛС-15 прлучен с использованием традиционных генетикоселекционных приемов из штамма Candida

regulnll 316. Процесс получения штамма включает обработку сгущенной суточной суспензии клеток штамма С.regulnil мутагеном (0,0075М фенетил-ди-2-хлорэтиламин) и отбором мутантных клонов с использованием селектирующего агента — монофторуксусная кислота (7,8 гlл). Из выросших на среде с антиметаболитом (МФУ) 10-15 кло1705338 нов целенаправленно отбирают штамм

С.regulnll ЛС-15, обладающий наивысшей активностью алкогольдегидрогеназы.

Полученный штамм дрожжей Candida

regulnli ЛС-15 депонирован во Всес 1юэной коллекции микроорганизмов ИБФМ АН

СССР под номером BKM CR-321 Д.

Штамм характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиолого-биохимическими признаками, Культурально-морфологические признаки.

Клетки удлиненные, единичные, веретенообразные, длина 4,5-9,0 мкм, ширина

1,5-3,0 мкм, Рост на жидких средах.

Солодовое сусло 7 по Баллингу, 26 С, двое суток (без встряхивания) серая пленка, сползающая на стенки, небольшой осадок белого цвета, среда без изменений

Через месяц (17 С) при стоянии пленка на стенке сосуда, опускающаяся на дно (на качалке) осветление среды сильное помутнение среды, кольцо отсутствует выпадает обильный осадок белого цвета осветление среды

Жидкая минеральная среда с этанолом (2,0 об;ь), 3-е сут, качалка, 30 С

Сильное помутнение белого цвета, выпадает обильный осадок белого цвета, Через месяц (17 С) при стоянии пленка не образуется.

Подкисление среды с рН от 4,5 до 3,2.

Рост на плотных средах.

Сусло-агар, 30 С, трое суток, (посев штрихом) рост обильный, непрозрачный, край зубчатый, серо-белого цвета, колонии круглые, до 10 мм, матовые, край зубчатый, консистенция пастообраэная, профиль слабо выпуклый, серо-белого цвета, Через месяц (17 С) колонии кремового цвета, слегка гранулированы, опушенные псевдомицелием.

Минеральная агаризованная среда с этанолом (2,0 об, ), трое суток, 30 С, (посев штрихом); рост обильный, сплошной, переходящий в цепочку отдельных колоний, край ровный, серо-белого цвета, колонии круглые, 3,5 мм, матовые, край ровный, профиль слабо выпуклый, пастообразной консистенции, серо-белого цвета.

Через месяц (17 С) колонии серого цвета, не гранулированы, край не опушен псевдомицелием.

Рост на глюкоэо-картофельном arape: на стекле отдельные клетки и псевдомицелий.

Кукурузный агар: на стекле (анаэробные условия) псевдомицелий и почкующиеся клетки.

Истинный мицелий и артоспоры отсутствуют, Растет без витаминов на среде Ридер+глюкоза.

Физиолого-биологические признаки

Температурный диапазон роста 8-43 С.

Оптимальная температура роста 28-38ОС.

Максимальная скорость роста 37-40 С. Оптимум рН 3,8-4,5.

Растет на среде с 50 глюкозы,,не растет на среде с 107; NaCI.

Сбраживает только глюкозу на среде: дрожжевая вода+2,07; углевода. Ассимилирует глюкозу, этанол. глицерин, молочную кислоту, янтарную кислоту, лимонную кислоту. Не ассимилирует галактозу, сахарозу. мальтоэу, целлобиозу, лактоэу рафинозу. крахмал, ксилоэу, L-арабинозу, О-арабинозу, рибоэу, рамноэу, маннит, иноэит.

Нитраты и нитриты не ассимилирует.

Усваивает мочевину, аммонийные соли, пептон, аспарагин, не усваивает желатину.

Обладает уреазной активностью (на среде Христенсена).

Хорошо хранится в лиофильно высушенном состоянии. Штамм не токсичен и нв патогенен.

Штамм ВКМ ИБФМ АН СССР CR-321 Д идентифицирован как штамм вида Candlda

regulnii, Посевной материал получают выращиванием штаммов С.regulnll ËÑ-15. С,regulnli

316 — 232, С.regulnll 316 в колбах в жидкой питательной среде следующего состава, г/л: мочевина 2.0; йаН2Р04 2Н20 3,5;

К2Н Р04 ЗН20 3,8; Мц 504 7НгО 1,4: кОнцвнтрат микроэлементов 2 мл; этиловый спирт

2,0 об,, вода дистиллированная до 1 л.

Величину рН доводят фосфорной кислотой до 4,5. Этанол и соль Mg вносят в колбы после автоклавирования.

Полученный посевной материал в количестве 8-10 от объема питательной среды (50 мл) вносят в колбы со свежей средой (состав приведен выше). Культивирование осуществляют при 30 С на качалке (200 об/мин). По мере роста штаммов через определенные промежутки времени (1,5-2,0 ч) урожай биомассы (каждый раз берут отдельные колбы) клеток отделяют от культуральмой жидкости с помощью центрифугирования (3000 об/мин) и отмывают от компонентов питательной среды 0,1 М фосфатным буфером (рН 7,0). Затем клетки подвергают деструкции с помощью экструзии иэ

1705338

316

ЛС вЂ” 15 BKM CR — 321

316-323

Опыт время культивирования для достижения максим. активности, ч

Время культивир, для достижения максимальной активности, ч уд. активность АДГ, ед/мг уд. активность АДГ. ед/мг уд. активность АДГ, ед/мг время культиви рования для достижения максимальной активности, ч

1,20

1,22

1,72

1.38

3,6

3,5

3,1

3.4

21,0

25.0

26,0

24,0

19,0

16,0 16.0

17,0

15,0

13,0

14,0

14,0

2,54

2,21

2,06

2,27

2

С е няя

Составитель В.Соина

Редактор В.Трубченко Техред M.Ìîðãåíòaë Корректор M,Äåì÷èK

Заказ 170 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 замороженного состояния. Полученный дезинтеграт центрифугируют (12000 об/мин) в течение 20 мин для отделения целых клеток, клеточных осколков и супернатант анализируют на наличие алкогольдегидрогенаэой активности с использованием спектрофотометрического метода. Удельную активность фермента выражают в ед/мг — количество мкМ НАД, восстановленного ферментом эа 1 мин. разделенное на количество белка (мг) внесенного в реакционную смесь, В таблице приводятся данные сопоставительного анализа по уровню активности

АДГ и времени достижения максимальной активности, полученные при экспериментальной (лабораторной) проверке всех трех штаммов.

П реи мущест ва штамма С. гед Ы п11 Л С15В КМ CR-321 Д по сравнению со штаммом

С.regulnll 316-232 и С.reguinll 316: — более высокий уровень удельной активности алкогольдегидрогенаэы (на 50 в среднем для штамма 316-323 и на 146 (в среднем для штамма 316).

5 — менее короткий срок ферментации для достижения максимальной активности, что позволяет в условиях производства экономить электроэнергию, а также получать более высокий выход целевого продукта с

10 единицы объема ферментационного оборудования.

Таким образом, штамм Candlda regulnll

ЛС-15 CR-321 Д не только превосходит по уровню активности алкогольдегидрогеназы

15 известные штаммы, но и является более технологичным по своим свойствам.

Формула изобретения

Штамм дрожжей Candlda regulnll ВКМ

20 CR-321 Д вЂ” продуцент алкогольдегидрогенаэы.