Способ инактивации женского пронуклеуса неоплодотворенной икры костистых рыб
Использование: обпасть разведения. получение мутаций, генная инженерия рыб. Сущность изобретения: неоплодотворенные яйцеклетки костистых рыб выдерживают в воде в течение периода времени, который составляет от одного до двух временных интервалов между двумя последовательными синхронными делениями дробления у используемого вида костистых рыб при постоянной температуре СО | о. о о а
союз советских
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕ ННЫ Й КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
0л
С) о
1 (21) 4908700/13 (22) 14.12.90 (46) 15.09.92. Бюл. N. 34 (71) M ГУ им. M. В, Ломоносова (72) Л,А. Слепцова и Д.В. Попов (56) Нейфах А, А. Использование метода радиационной инактивации ядер для исследования из функции в раннем развитии рыб.//Журн. общ. биол„1959, т. 20, с. 202—
213, Кунина И.М„T.Л., Тимофеева
М.Я. Определение оптимальных условий физической и химической инактивации ядер для получения гаплоидных и безядерных зародышей вьюна.//Онтогенез, 1975, т. 6, ¹
3, с. 304-308.
Yan Shaoyi. The nucleo-cytoplasmic
interactions as revealed by nuclear
transplantation in fish. 33//Cytoplasmic
organization systems. 1989, Мс. Оган — Hili
Publishing Company, р. 61 — 81, Детлаф Т.А„Детлаф А.А. О безразмерных характеристиках продолжительности разития в змбриологии.//Докл, АН СССР, 1960, т, 134, с. 199 — 202, Хунг Н.М„Газарян К.Г. Пересадка соматических ядер в активированные яйца костистых рыб (на примере вьюна Misgurnus
fossilis 1.)//Онтогенез, 1978, т. 9, ¹ 1, с. 85-90, Дабагян H.Â., Слепцова Л.А„Балданова Д,Р., Газарян К.Г. Оплодотворение и ранее дробление яйцеклеток вьюна (Misgurnus fossilis 1.)//Журн, общ, биол„
1981, т, 42, ¹ 3, с. 440 — 447, Шадрин А.M.. Махотин В.В. Описание нормального развития Brachydanio rerio (Hamilton — В испапап)(Сург!побопббае, Pisces)//Âåñòí. Моск. ут-та, сер. 16, Биология, 1989, № 2, с. 39 — 45, »5U „1761066 А1 (si)s А 01 К 61/00, С 12 N 15/00 (54) СПОСОБ ИНАКТИВАЦИИ ЖЕНСКОГО
ПРОНУКЛЕУСА НЕОПЛОДОТВОРЕННОИ
ИКРЫ КОСТИСТЫХ РЫБ (57) Использование; область разведения, получение мутаций, генная инженерия рыб. Сущность изобретения; неоплодотворенные яйцеклетки костистых рыб выдерживают в воде в течение периода времени, который составляет от одного до двух временных интервалов между двумя последовательными синхронными делениями дробления у используемого вида костистых рыб при постоянной температуре.
1761066
Изобретение относится к способам разведения, получения мутаций и генной инженерии рыб, и может быть применено в практике экологических, а также экспериментально-эмбриологических исследований.
Известен способ инактивации женского пронуклеуса неоплодотворенной икры костистых рыб путем искусственного получения зрелой икры от самок, подвергшихся гормональной стимуляции, и облучения такой икры высокими дозами рентгена при помощи установок, Известно, что цитоплазматические факторы наследственности оказывают большое влияние на формирование фенотипа ядерно-цитоплазматических гибридов костистых рыб путем механического удаления генетического материала из яйцеклеток.
Этот способ, принимаемый нами наиболее близок к предлагаемому и заключается в том, что неоплодотворенные яйцеклетки активируют путем помещения их в воду и затем с помощью специальных микрохирургических инструментов механически удаляют из таких икринок женский и ронуклеус.
Целью предлагаемого способа является упрощение способа инактивации, повышение процента яйцеклеток с инактивированным пронуклеусом, а также расширение функциональных возможностей способа и повышение надежности метода за счет проведения инактивации пронуклеуса неоплодотворенной икры костистых рыб путем выдерживания икры в воде в течение определенного периода времени.
Для этого, неоплодотворенные яйцеклетки (зрелую икру) костистых рыб выдерживают в воде в течение периода времени, который составляет от 1 — 2 то от момента активации, т, — временной интервал между двумя синхронными последовательными делениями при постоянной температуре.
Следует отметить, что при обработке икры водой в течение периода времени меньше указанного пронуклеус остается жизнеспособным и может принимать участие эмбриогенеза, при этом обработке водой в течение периода времени большеуказанного приводит к утере цитоплазмой яйцеклетки способности отвечать на стимул пересаженного ядра в опытах с трансплантацией ядер. В течение же указанного промежутка времени пронуклеус яйцеклетки полностью дегенерирует, что позволяет не применять предварительного механического удаления пронуклеуса яйцеклеток микрохирургическим способом, приводящим к повреждению большей части используемой в опыте икры и требующим сложных микрохирургических манипуляций.
Пример. В качестве донора яйцеклеток берут половозрелую самку вьюна, иньецируют хроническим гонадотропином и получают зрелую икру, которую помещают в холодильник при температуре 4 С. Небольшую часть икринок заливают водой и выдерживают в течение 30 мин при комнатной температуре, после чего производят операцию трансплантации в них ядер бластулы вьюна по описанной ранее методике, Опираясь на данные по нормальному развитию вьюна, полученные ранее, производят фиксацию экспериментального материала через 209 минут после операции, Срезы толщиной 6 мкм окрашивают гематоксилином по стандартной методике, препараты анализируют с помощью светооптическог0 микроскопа с общим увеличением 400х. Установлено, что в данном случае пронуклеус дегенерирует и не принимает участия в эмбриогенезе, то есть он полностью инактивирован. Полученные в результате операции зародыши не отличаются от контрольных (см, табл. 11, Другие примеры приведены в табл, 1
{последовательность операции та же, что в примере 1. Из таблицы видно, что выявлен интервал, в течение которого пронуклеус яйцеклетки полностью инактивирован, Формула изобретения
Способ инактивации женского пронуклеуса неоплодотворенной икры костистых рыб, включающий активацию неоплодотворенной икры путем обработки ее водой, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, повышения процента жизнеспособных яйцеклеток с инактивированным пронуклеусом, расширение функциональных возможностей способа и повышения его надежности, обработку проводят выдерживанием неоплодотворенной икры в воде в течение периода времени, который составляет от одного до двух временных интервалов между двумя последовательными синхронными делениями дробления у используемого вида костистых рыб при постоянной температуре.
1761066
5 3
5 с
Ф о
Ф а а сд
Ф Ф о л
* X
c <
Ф S о а с о с с
Ф
S
1S
63
1 и
О 5 с CO о о
Х л— л с
1- }а-о ?
Ф а Ф с Q
z о о ж i с> о
О O
Ь
lO
CL и с(15 K
Ф о
О О
Е z
S X
fO Ф () )(Ф а. v
Ф Ф - а.
Ф с
О
Х 5 о X сО Q л I г о о О; Xz5 Ф Ф аg Ф tQ O 5 CV Ф Ф с о ш С4! Ю о CV о CO lЩ i Z 5 О 5 5 о Е Ф CL Ш (О Г Q) Ф с о LQ 1! с1 о X 1 о (О Ф Ф с о CO (D 1 о 2 л CO t2 О У аo 5 1а. Ф с C о О 5 Ф К о 1Ф л z с о о 5 о) ) с ) о X Я =т Щ CL Ф с о lЩ с л Ф CO v o о Ф g) с У » Y z Ф о CL г» 5 с о с 5 к pi) сб о ас с S с (б X о z сС о I» о Ф z v >,Ж Ф Ф (с ) Ф:» + о а- а + c с У Ф Ж Ф асч с о S с О С 5 - сС х о 5 С i c S р, Ф Ф Я Ф Ф tK 5 с о с о с S У Щ 5 Ф о и >5 Ф с( о 5 CO о оо Фо cУ :» z о CL S o =1 о mo 
