Рекомбинантная плазмидная днк phiv 24-5, кодирующая слитый белок кор-антигена вируса гепатита в и белок оболочки вируса иммунодефицита человека, и штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент слитого белка кор-антигена вируса гепатита в и белка оболочки вируса иммунодефицита человека

 

Изобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности и биотехнологии. Целью изобретения является получениебелка, обладающего иммуногенной активностью кор-энтигенаи вируса гепатита В и белка оболочки вируса иммуноИзобретение относится к микробиологической и медицинской промышленности и биотехнологии. Целью изобретения является получение белка, обладающего иммуногенной активностью кор-антигена вируса гепатита В и белка оболочки вируса иммунодефицита человека . Сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК, состоящая из следующих элементов: дефицита человека. Изобретение позволяет получить слитый белок НВсАд , состоящий из 114 N-концевых аминокислот кор-антигена вируса гепатита В (НВУ) и полной аминокислотной последовательности белка р24 вируса иммунодефицита человека (ВИЧ). Такие белки обладают иммунологической активностью как НВсАд, так и белка р24 ВИЧ. Помимо 144 аминокислот НВсАд рекомбинантный белок НВсАд AHIVp24 содержит следующие последовательности гена gag ВИЧ: 13 аминокислот белка р17, 231 аминокислоту р24 и 74 аминокислоты р15. Синтез белка кодирует рекомбинантная плазмида pHIV 24-5, которая состоит из ДНК плазмиды рНВсб, несущей ген НВСАд с оптимизированным участком инициации трансляции и с терминирующим кодоном по 144-й аминокислоте гена, и фрагмента генома ВИЧ, клонированного в плазмиде рВНЮ и соответствующего последовательности между сайтами рестрикции Pvull и Bglll в гене gag. Размер плазмиды 7900 п.о., мол.м. 5,06 МДа Ген Ыа обеспечивает устойчивость плазмиды к ампициллину. Ген НВсАд Д- HIVp24 находится под контролем тандема промоторов триптофанового оперона. 2 с п. ф-лы, 2 табл ДНК плазмиды рНВс5, которая является производным плазмиды рНВсЗ, несущей ген НВсАд с оптимизированным участком инициации трансляции, но с укороченным геном НАсАд, лишенным 39 N-концевых аминокислот и снабженным уникальным сайтом рестрикции EcoRI no 144-й аминокислоте гена, протяженностью 6700 п.о., фрагмента генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), клонированного в плазмиде рВНЮ, соответствующего послеXI сл пшД Ю о ю

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 15/51, 15/33, 15/70

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

1 .:,: ":..:. 2 (21) 4746434/13 ., -:::: - -"::::: дефицита человека, Изобретение позволяет (22) 10.08,89:- ":.... ;.::;:,.::::.: .. получить слитый белок HBcAg Ь-НИр24, . (46) 30.07.92, Бюл . М 28 .,:; ....: состоящий из 114 й-концевых амйнокислот . (71) Институт органического синтеза кор-антигена вируса гепатита В(НВУ)йпол: АН ЛатвССР и Отдел медицины (Шарите) ной аминокислотной последовательности Университета Гумбольдта (Берлин) (DE) белка р24 вйруса иммунодефицита. человека, (72) Райнер Ульрих, Регина Меринг, Инг- (ВИЧ),Такиебелкиобладаютиммунологиче. рид Лэтч, Гюнтер Петцольдт, Томас По- - ской активностью как HBCAg, так и белка рстман-, Ханс Альфред Розентaль (DE); р24 ВИЧ. Помимо 144 аминокислот НВсАд

Г. П. Борисова, И; Г, Берзинь, Д,.Э. Дрейли--: рекомбинантйый белок HBcAg Ь Н!Чр24 соня, В. Я. Лосева, Ю. А. Озолс, B. П. Осе держит следующие последовательности геB. В. Цибиногин, П. Il. Пумпен и Э, Я. Грен на ца9 ВИЧ: 13 аминокислот белка р17, 231 (56) Miiich D. R. Immunology Тодау, 1989, 9, аминокислоту р24 и 74 аминокислоты р15.

-.:380-386. -:, : ; -.:.".-:::... ;:."::,: -..; Синтез белка кодирует рекомбинантная (54) РЕКОМБИЙАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ,. плазмида рНЙ 24-5; которая состоит из

ДНК рНИ 24-5, КОДИРУЮЩАЯ СЛИТЫЙ ДНК плазмиды рНВс5, несущей ген HBCAg

БЕЛОК КОР-АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИ- с оптимизированным участком инициации

ТА B Й БЕЛОК ОБОЛОКИ ВИРУСА ИММУ-: трансляции и с терминирующим кодоном по

НОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЕКА, И ШТАММ 144- и аминокислот6 гена, и фрагмента геноБАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI — ПРОДУ- . ма ВЙЧ, клонированного в плазмиде рВН10

ЦЕЙТ СЛИТОГО БЕЛКА КОР-АЙТИГЕНА . и соответствующето последовательности

ВИРУСАГЕПАТИТАВИ БЕЛКАОБОЛОЧКИ :. между сайтами рестрикции Pvull u Bglll в

ВИРУСА ИММУНОДЕФИЦИТА ЧЕЛОВЁКА гене gag. Размер плазмиды 7900 п.о„мол.м. (57) Изобретение относится к микробиоло - 5,06 МДа. Тен Ыа обеспечивает устойчигической и медицинской промышленности и -": вость плазмиды к ампициллину. Ген НBcAg биотехнологии. Целью изобретения являет-. Л вЂ” Н Ир24 находится под койтролем тандеся получениебелка, обладающего иммуно- ма промоторов триптофанового оперона, 2 генной активностью кор-антигенаи вируса с,п, ф-лы, 2 табл. гепатита B и белка оболочки вируса иммуноИзобретение относится к мйкробиологической и медицинской промышленности и биотехнологии.

Целью изобретения является получейие белка, обладающего иммуногенйой активностьго кор-антигена вируса гепатита В и белка оболочки вируса иммунодефицита человека;

Сконструирована рекомбинантная плазмидная ДНК, состоящая из следующих элементов:

ДНК плазмиды рНВс5, которая является производным плазмиды рНВс3, несущей ген HBcAg с оптимизированным участком инициации трансляции, но с укороченным геном HAcAg, лишенным 39 N-койцевых аминокислот и снабженным унйкальйым сайтом рестрикции EcoRI йо 144-й аминокислоте гена, протяжейностью 6700 п,о., фрагмента генома вируса иммунодефицита человека (ВИЧ), клонированного в плазмиде рВН10, соответствующего после1751209 довательности между сайтами рестрикции.

Pvull и В91И, кодирующего 13 аминокислот белка р17, 231 аминокислоту р24 и 74 аминокислоты р15 и снабженного терминирующйм кодоном в фазе трансляции белков

ВИЧ, протяженностью 949 п,о. фрагмента плазмиды pVC19, протяженностью 211 п.о.

Размер плазмиды 7900 п.о., мол.м. 5,06

МДа.

В состав ДНК рекомбинантной плазмиды pHIV 24-5 входят гены; ген HBCAg Л вЂ” HIV р24, обеспечивающий синтез конечного продукта; ген bla, обеспечивающий устойчивость к ампициллину.

Ген HBcAg Ь вЂ” НИ р24 находится под контролем тандема промоторов Р гр, Плаэмида pHIV 24-5 амплифицируется при добавлении в среду хлорамфеникола, некоъюгативна.

Штамм-продуцент HBcAg Л вЂ” НИ р24 получают трансформацией клеток Е. col!

К802 рекомбинантной плазмидной ДНК рНР/ 24 — 5.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки: клетки па. лочковидной формы, грамотрицательйые.

Культуральные признаки; клетки растут на обычно используемых питательных средах; образуют колонии средней величины, Физико-.биохимические препараты, оптимальная температура культивированйя—

37 С, оптимум рН 7,0-7,4, В качестве источника углерода используют углеводы, в качестве источника азота — минеральные соли, а также органические соединения в вйде пептона, триптона, аминокислот.

Устойчивость к антибиотикам, устойчив

k амййциллину, что обусловлено наличием плаэмиды. Присутствйе в штамме плаэмидной ДНК подтверждают путем проверки устойчивости к ампициллину, а также путем выделения и анализа плазмидных ДНК. .Продуктивность штамма 1% химерного белка HBcAg Л вЂ” НИ р24 от суммарного клеточного белка (по результатам сканирования электрофореграмм белков, окрашенных серебром).

Штамм депонирован в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов под номером ВКПМ В-4970, Пример 1. l. Конструирование рекомбинантной плаэмидной ДНК pHIV 24-5.

2 мкг плазмиды рНВс5 расщепляют . 5 ед. рестриктазы EcoPI в 25 мкл раствора

А, содержащего 0,1 М трис-НС1, рН 7,5; 0,05 М

NaO и 10 мМ Mg С1, а течение 1 ч при 37 C.

20

40

55

Рестриктазу инактивируют 15-минутным прогреванием при 65 С. Заполнение липких концов проводят в 100 мкл раствора Б, содержащего 50 мМ трис-НС1, рН 7,5, 10 мМ

MgClz, 10 мМ дитиотрейтол, 25 мМ NaCI, 100 мкМ dATP, dCTP, dTTP u dGTP и 5 ед. ДНКполимераэы Е, со!1 (фрагмент Кленова), в течение 1 ч при 12 С. После очистки на агарозном геле ДНК растворяют в 20 мкл НгО (ДНК 1).

20 мкг плазмиды plN G3 расщепляют 50 ед. рестриктазы Pvull в 100 мкл раствора В, содержащего 10 мМ трис-HCI, рН 7,5, 50 мМ

NaCI и 10мМ М9С1г, в течение 2 ч при 37 С, наносят инкубацйонну1о смесь на 1,5%-ный агарозный-гель, фрагмент размером 1159 п,о, (мол.м, 0,74 МДа). несущйй полную последовательность р24 с фланкирующйми участками, выделяют из агароэного геля (Д Н К 2). -0,25 мкг ДНК 1 и 0,1 мкг ДНК 2 сшивают

Т4 ДНК-лигазой в 10 мкл раствора Г, содер- . жащего 50 мМ трис-HCI, рН 7;5, 10 MM

МЫС!2. 10 мМ дитиотрейтол, 50 мкМ АТР и

10 ед. Т4 ДНК-л ; в течение 12 ч при

12 С. Для трансформации клеток к реакци- . онной смеси добавляют 100 мкл клеток Е. соП RR1, обработанных 0,1 М CaClz (конечная концентрация — 5 х 10 клеток/мл).

Отбор клоH08 "осуществляют путем рестрикционного анализа плазмидной ДНК, выделенной экспресс-методом. Плаэмида с ожидаемой рестрикционной картой получает наименование рНИ 24-5, 2. Штамм-продуцент E. соИ К802 (pHI

24 — 5), Штамм-продуцейт получают трансформацией клеток Е. со11 К802 рекомбинантной плазмидной рНИ 24-5, Клетки выращивают до оптической плотности ОП65о 4-5 в солевой среде М9 с добавкой, г/л: каэаминовые кислоты 10; глюкоза 2; ампициллин. 0,02.

Клетки собирают центрифугированием и лизируют в четырехкратном обьеме буфера, содержащего 0,05 M трис-HCI, рН 8,0; 0,15

М МаС1, 0,1% тритон Х 110000,, 00,005 М ЭДТЛ, 2 мг/мл лизоцима, После инкубации в течение

30 мин при 4 С клетки подвергаюттрехкратному замораживанию — отгаиванию, добавляют дезоксирибонуклеазу и М9С!г .до конечной концентрации 20 мкг/мл и 10 мМ соответственно и инкубируют 30 мин при

4 С, Лизат после центрифугирования (10 000 g, 4 С, центрифуга Т24) удаляют, осадок суепендируют в растворе, содержащем 62,5 MM трис-HCII, рН 6,8; 2% додецилсульфат натрия (ДСН), 2% Р-меркаптоэтанол, Иммунологическую активность белка определяют с помощью иммуноблотинга.

1751209

Л р и м е р 2, Для иммуноблотинга ствует о наличии р24-активности, для коликлетки(6 мг)суспендируют в 100 мл буфера . чественной оценки активности измеряют для нанесения образцов на полиакри- оптическую плотность при 492 нм (табл; 1). ламидный гель, содержащий 2%-ный Отсутствие реакции в отрицательном контдодецилсульфат натрия (ДСН) и 2%-ный - 5 роле (HBcAg) свидетельствует о специфичР-меркаптоэтанол илизируют2мин про- ности связывания анти-р24 антител греванием на кипящей водяной бане. Пол- рекомбинантным,белком HBcAg Л вЂ” HIV р24 ученные лизаты (2 — 4 мгlмл белка) наносят (табл. 1). на полиакриламидный градиентный гель . Приведенные данные свидетельствуют (12 23%) размером 150х150х0,75 мм. Элек- 10 о бифункциональной антигейности белка трофорез проводят в течение 15 ч при силе HBcAg Л- HIV р24 и, следовательно, служат тока 7 мА. После электрофореза белки пере- примером использования целевого белка носят на нитроцеллюлозные фильтры. для иммунодиагностических целей.

Фильтры инкубируют с моноклональными Иммуногенная активность рекбмбинананти-р24 антителами MAI4/4/1 в раэведе- 15 тного белка HBcAg Ь- НИ р24. нии 1:500 на буфере TВS; содержащем 50 Для определения иммуногенности ремМ трис-HCI, рН 7,8; 0,15 М NaCI, 0,1% комбинантйым белком HBcAg Л вЂ” HIV р24 тритон Х 100, с 1% БСА в течение I5 ч при, иммуйиэируют кроликов. Для этого смеши20 С, После трехкратной отмывки буфером вают 2 мг антигена, растворенного в 1 мл

TBS фильтры инкубируют 2 ч при 20 С с 20 физиологического раствора PBS; с 1,25 мл . конъюгатом пероксидазы хрена с антитела- полного адъюванта Фрейнда и йолучают гоми против иммуноглобулинов человека в могенную эмульсйю, Антиген вводят подразведении 1:16 на буфере TBS:с 1% БСА. кожно. Инъекции антигена повторяют на

В параллельной постановке фильтры инку- 14-й и 21-й день и с 28-го дня начинают ..: бируют с моноклональными антителами 25 брать кровь, Специфичность антител ойре14Е11 в разведении 1:50 на буфере TBS с деляют методом ИФА:с исйользовайием

1% БСА течение 15 ч при 20 С, отмывают, двух антигенав: HBcAg (для определения как описайо выше, и инкубируют в течение анти-НВс антител), рекомбинантного белка о

2 ч при 20 С с конъюгатом пероксидазы р-галактоэидаза-р24(дляопределенияантихрена с белком А S. aureus. После инкуба- 30 р24 антител). Титры антител на 28-й день ции с пероксидазными конъюгатами фильт- иммунизации приведены в табл. 2. ры в обоих случаях отмывают буфером TBS Приведенные данные свидетельствуют (3-5 раз) и проявляют дйаминобензидйном, о наличии бифункциойальной иммуногенно-.

Лизаты клеток штамма — продуцента обна-:сти у данного белка. руживают в обоих случаях специфические 35 Таким образом, предлагаемое изобре-. .эоны окраски, соответствующие белку с тение позволяет получить слитный белок, мол.м. 49 кда (или длиной 462 аминокислот). обладающий бифункциональной активноПример 3, В качестве твердой фазы стью как по белку кор-антигена вйруса гепаиспользуют палистироловые 96-луночные . тита В, так и по белку оболочки вируса планшеты для иммунологических реакций. 40 иммунодефицита человека. . Слитый белок разводят до концентрации Ф о р м у л а и э о б р е т е н и я

10мкг/мл в50мМ йаНСОз — йа2СОз, рН9,5, 1. Рекомбинантная плазмидная ДНК вносят в лунки йланшетов по 100 мкл в каж- pHIV 24 — 5, кодирующая слитый белок коро дую, инкубируют 16 ч при 37 С, после чего антигена вируса гепатита В и белок оболочраствор удаляют из лунок, планшеты высу- 45 ки вируса иммунодефицита человека, шивают. В лунки вносят моноклональные размером 7860 п.o., содержащая анти-р24 МАК4/1/1 в разведении 1;5000 íà EcoRI-EcoRI фрагмент ДНК плазмиды .. буфере ТВ$. После инкубации в теченйе 2 ч рНВс5, размером 6700 п.о., при 37 С планшеты отмывают 5 — 6 раз дис- . Pvull — Pvull — фрагмент дНК плазмиды тиллированной водой и вносят по 100 мкл 50 plVG3 с частью генома вируса иммунодефи icîíüioãàòa пероксидаэы хрена с антителами цита человека, размером 1160 п.o.; против иммуноглобулинов мыши 1:5000 на уникальные сайты рестрикции с коордибуфере TBS. После инкубации в течение 1 ч натами: планшеты отмывают и проводят цветную . BamHI 0 (начало координат) реакцию, В лунки вносят по 100 мкл 0,25%- 55 Sall 276 ного раствора ортофенилдиамина ° 2HCI в Norul 599

0;1 M цитрате натрия, рН 5,0, 0,02% Н202, Sngl 1871 инкубируют 30 мин при 20 С, реакцию оста- А еШ 2098 навливают добавлением 100 мкл 0,1 н.KCI. Seal 3471

Появление коричневой окраски свидетельГ

1751209

5176

6087

Xbal

Hind Ill

Таблица 1. 15 ..-:: -::

Иммуногенность химерного белка НВсАо Ь- HIV p24

Таблица 2

Ъ с:1

Составитель Т.Забойкина

Техред М.Моргентал Корректор С.Пекарь.:

Редактор Л.Павлова

Заказ 2665 .: . Тираж " Подпйсное . ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушскэя наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород,.ул.Гагарина, 101

2 сайта рестрикции Sphl — 191 и 5832

2 сайта рестрикции Pstl — 3236 и 5794; гены, генетическйе маркеры и регуляторные участКи: ген HBcAg Ь- HIV р24, обеспечивающий сийтез рекомбинайтного белка

HBcAg Л вЂ” HIV р24, — координаты 50876471; ген Ыа, обеспечивающий устойчивость к ампициллину, координаты 2918-3778; точку начала репликации — координаты

2153-2159; .

5 ген HBt:Ag Ь- HIV р24. находящийся иод контролем тандема промоторов Ptrp,.— кобрдинаты 4905-4937 и 5015 — 5047-.

2, Штамм бактерий: Escherlñhlà со!! ВКОМ В-:4970:- продуцент слитого белка

10 "кор-антигена йируса гепатита В и белка оболочки вйруса иммунодефицита человека.,