Способ определения инсулинорезистентности у больных сахарным диабетом i типа

 

Изобретение относится к клинической медицине. Цель изобретения - повышение точности диагностики инсулинорезистентности. Для осуществления способа лимфоциты крови донора инкубируют с сывороткой крови больного, разведенной питательной средой в интервале соотношений 1:10 до 1:20, при температуре +37°С в течение 30 мин, добавляют к ним эритроциты барана, сенсибилизированные инсулином , и по усилению их взаимодействия при увеличении числа инсулиновых розеток в три и более раз определяют в крови наличие антител к инсулинорецепторам и диагностируют у больного сахарным диабетом инсулинорезистентность иммунного генеза. Предлагаемый способ дает также возможность раннего выявления антирецепторных антител в крови больных диабетом, что позволяет диагностировать начало развития инсулинорезистентности.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕ СКИХ

РЕСПУБЛИК (я)л G 01 N 33/53

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4762589/14 (22) 28.11.89 (46) 15.09.92, Бюл. ЬЬ 34 (71) Пермский государственный медицинский институт (72) А,А.Быкова. Т.А.Юшкова и E.Â.Áûêîâà (56) Потемкин В.В. Эндокринология, М„

1986. с.250. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ИНСУЛИНОРЕЗИСТЕНТНОСТИ У БОЛЬНЫХ САХАРНЫМ ДИАБЕТОМ I ТИПА (57) Изобретение относится к клинической медицине. Цель изобретения — повышение точности диагностики инсулинорезистентности. Для осуществления способа лимфоциты крови донора ин кубируют с

Изобретение относится к области клинической медицины, а именно к лабораторной диагностике инсулинорезистентности у больных сахарным диабетом I типа.

Согласно данным литературы, в патогенезе инсулинорезистентности участвуют аутоантитела к специфическим рецепторам.

Ранее выявление этих антител обеспечит своевременную профилактику развития реэистентности к гормону и соответствующую ее терапию. Однако. методов выявления антител и инсулинорецепторэм, пригодных для клиники, в доступной медицинской литературе не обнаружено.

Целью изобретения является повышение точности диагностики инсулинорезистентности.

Способ осуществляют следующим образом.

„„Я „„1762241 А1 сывороткой крови больного, разведенной питательной средой в интервале соотношений 1:10 до 1:20, при температуре+37 С в течение 30 мин, добавляют к ним эритроци-. ты барана, сенсибилизированные инсулином, и по усилению их взаимодействия при увеличении числа инсулиновых розеток в три и более раз определяют в крови наличие антител к инсулинорецепторам и диагностируют у больного сахарным диабетом мнсулинорезистентность иммунного генеза.

Предлагаемый способ дает также возможность раннего выявления энтирецепторных антител в крови больных диабетом. что позволяет диагностировать начало развития инсулинорезистентности, 8 две центрифужные пробирки (одна— для определения исходного содержания инсулиновых розеток в суспензии лейкоцитов крови донора, другая — для изучения дейст- 0 вия на клетки сыворотки крови обследуемого) забирают по 0,1 — 0:2 мл крови в 0,1-0,2 мл 5 свежеприготовленного раствора цитрата натрия для предупреждения свертывания крови. После тщательнОго встряхивания содержимого пробирок в него вносят для лизирования эритроцитов по 0,8 — 0;9 мл дистиллированной воды. Смесь встряхивают «в

20-30 секунд и добавляют до 10 мл среду

199, Суспензии клеток центрифугируют 5-6 минут при 1500 об/мин, после чего надосадочную жидкость отсасывают пипеткой, вновь добавляют 1 мл среды 199 и снова центрифугируют. Отсосав надосадочную жидкость, осадок одной пробирки оставляют временно без воздействий. Осадок ато1762241

15 среды 199

25

40 рой пробирки соединяют с 0,1-0,2 мл исследуемой, полученной путем отстаивания крови, декомплементированной сыворотки крови больного, разведенной средой 199 в интервале отношений от 1:10 до 1:20. Смесь осторожно встряхивают и инкубируют при температуре +37 С в течение 30 минут. После инкубации с сывороткой лейкоциты отмывают изотоническим раствором хлорида натрия путем центрифгуирования при 1500 об/мин в течение 5--6 минут, затем надосадочную жидкость отсасывают пипеткой, После этого осадки в обеих пробирках ресуспендируют в 0,1--0.2 мл изотонического раствора хлорида натрия рН 7,2; К полученным взвесям лейкоцитов добавляют по

0,1 — 0,2 мл 0.5% взвеси эритроцитарного диагностикума, смесь инкубируют при температуре+37 С в течение 10--15минут. а затем в течение 18 асов в условиях холодильника (+4" С). Через 18 часов в обе пробирки добавляют 1 мл 50% бычьей сыворотки, .смесь центрифугируют при 15000 об/мин 5 — 6 минут, надосадочную жидкость сливают, а из осадков делаю мазки, которые высушивают на воздухе, фиксируют в этиловом спирте 20 — 25 минут и окрашивают по

Романовскому-Гимза. Просматривают под микроскопом при 900-кратном увеличении

100 лимфоцитов, отмечая среди них число (%) лимфоцитоB фиксирвBàâших на себе три и более эритроцита.

При вали«ли в сыворотк; крови больного антител к инс,линорецепторам отмечается активация лимфоцитов крови донора с увелич û":. :1 среди ниx числа лимфоцNãoв, спо-обных взаимодействовать с эритроцитами барана, нагруженными инсулином, и ростом числа инсулиновых розеток в 3 и более раз, На основании этих данных ставится диагноз п сулинорезистентности иммунного генеза.

Для приготовления диагностикума используют эритроциты баг ана, -. обработанные глютаровым альд,,гидом, Свежие эритроци-ы барана трижды отмывают изотоническим раствором хлорида натрия рН

7,2, центрифугируя взвесь в течение 10 минут при 1500 об/мин, Из отмытых эритроцитов готовят 5 „взвесь, соединяя 0,5 мг осадка эритроцитов и 9,5 мл эабуференного изотонического раствора хлорида натрия рН 7,2. Смешивают 5% взвесь эритроцитов с 0,25% свежеприготовленным раствором глютарового альдегида в соотношении 1:1.

Выдерживают снесь при температуре+37 С в течение 15 минут, после чего эритроциты тщательно отмывают от глютарового альдегида забуференным изотоническим раствором хлорида натрия и доводят тем же раствором до первоначального объема (5% взвесь). Приготовленные таким образом эритроциты хранятся при температуре+4 С в течение 6 месяцев.

Для сенсибилизации эритроцитов инсулином глютаризированные эритроциты QTмывают изотоническим раствором хлорида натрия рН 6.4 и доводят им же взвесь до первоначального объема. Затем соединяют с раствором инсулина, содержащим 20

Едlмл, в соотношении 1:1. Смесь оставляют при комнатной температуре на 20 минут. после чего отмывают дважды забуференным раствороьл натрия рН 7.2. Слив надосадочную жидкость, объем доводят до первоначального (5% взвесь). В реакции используют 0,5% взвесь сенсибилизированных эритроцитов, которую готовят из исходной (5%) взвеси путем соединения 1 мл ее с 9 мл

Пример 1. Больная Л-ва И.Е.. 18 лет, поступила в эндокринологическое отделе-. ние ОКБ г.Перми 5 января 1989 года с жало-.. бами на общую слабость, жажду, Больная с декабря 1988 года после перенесенного простудного заболевания, Была тяжелая диабетическая кома. Объективно: пониженного питания, весь 50 Kr. Тоны сердца приглушены, АД вЂ” 90/60 мм рт.ст., дыхание жесткое. Живот мягкий, печень увеличена и выступает а 1,5 см из-под реберной дуги.

Содержание сахара в крови 14,3-23,7 — 28,6 мlмоль/л, в моче — 4-3%, ацетон+. Ббльная получает 44 ЕД инсулина. Диагноз: сахарный диабет, I тип, тяжелая форма, лабильное. течение, декомпенсираванныи.

Диабетическая энц.-..Фалопатия, Хронический пиелонефрит. (1нсулинорезистенность, При изучении сыворотки крови больной в две центрифужные пробирки забирали по

0,1 мл крови в 0,1 мл 5% свежеприготовленного раствора цитрата натрия. После встряхивания содержимого пробирок в него вносили по 0,8 мл дистиллированной воды, а затем до 10 мл среду 199. Суспензии клеток центрифугировали 5 мин при 1500 o6/мин, после чего надосадочную жидкость отсасывали пипеткой, добавляли 1 мл среды и снова центрифугировали при том же режиме. .и сосав надосадочную жидкость, осадок одной из пробирок соединяли с 0,1 мл исследуемой, декомплементированной, сывороткой крови больного, разведенной средой 199 l:10 или 1:20. Смесь осторожно встряхивали и инкубировали при температуре +37 С в течение 30 минут. После инкубации лейкоциты отмывали изо оническим раствором натрия хлорида путем центрифугирования и отсасывали налосадочную жид1762241

10

30

40

50 кость. Затем осадки в обеих пробирках ресуспендировали в 0,1 мл изотонического раствора натрия хлорида рН 7,2. К полученным взвесям лейкоцитов добавляли по 0,1 мл 0,5% взвеси эритроцитарного диагностикума, и смесь инкубировали при температуре +37 С 10 минут, затем в течение 18 часов в условиях холодильника (+4 С). Через 18 часов в обе пробирки добавляли 1 мл

50 бычьей сыворотки, и смесь центрифугировали при 15 об/мин в течение 5 минут, Надосадочную жидкость сливали, а из осадков делали мазки, которые высушивали на воздухе, фиксировали этиловым спиртом 20 минут и окрашивали по Романовскому-Гимза. Просматривали под микроскопом 100 лимфоцитов. отмечая среди них лимфоциты, фиксировавшие на себе три и более эритроцита.

В сыворотке крови больной обнаружены антитела к инсулинорецепторам, так как сыворотка антивировала лимфоциты крови донора, увеличивая число инсулиновых розеток в 4,5 раза (разведение 1:10) и в 7,5 раза (разведение 1:20). На основе этих данных поставлен диагноз инсулинорезистентности имунного генеза.

Пример 2. Больной М-в Г.В., 32 года, поступил в эндокринологическое отделение

OKB г. Перми 2 ноября 1988 года с жалобами на боли в эпигастральной области, тошноту, рвоту, похудание, Болен с 1984 года. Обострение заболевания началось с 9 октября

1988 года. Объективно: больной истощен (15 кг). Сердце и легкие без особенностей.

Язык обложен. Живот резко болезненен в зоне проекции поджелудочной железы. Печень резко выступает из"под ребреного края на 5 см, Содержание сахара в крови

15,2 — 12,9 — 9,0 — 14,4 — 28,4 мlмоль/л, в моче—

6 — 7 ; Больной получает 208 ЕД инсулина.

Диагноз: хронический панкреатит, болевой вариант, рецидивирующее гечение, обострение. Панкреатический сахарный диабет, декомпенсация. Инсулинорезистентность.

При изучении сыворотки крови больного в две центрифузные пробирки забирали по 0,1 мл крови в 0,1 мл 57, свежеприготовленного раствора цитрата натрия. После встряхивания содержимого прсбирок в него вносили по 0,8 мл дистиллированной воды, затем до 10 мл среду 199. Суспензии клеток центрифугировали 5 мин при 1500 об/мин, после чего надосадочную жидкость отсасывали пипеткой, добавляли 1 мл среды и снова центрифугировали при гом же режиме.

Отсосав надосадочную жидкость, осадок одной из пробирок соединяли с 0,1 мл исследуемой, декомплементированной. сывороткой крови больного. разведенной средой 199 1:10 или 1:20. Смесь осторожно встряхивали и инкубировали при температуре <-37"С в течение 30 мин. После инкубации лейкоциты отмывали изотоническим раствором натрия хлорида путем центрифугирования и отсасывали надосадочную жидкость. Затем осадки в обеих пробирках ресуспендировали в 0,1 мл изотонического раствора натрия хлорида рН 7.2. К полученным взвесям.лейкоцитов добавляли по 0.1 мл 0,5% взвеси эритроцитарного диагностикума, и смесь инкубировали при температуре <-37 С 10 минут, а затем в течение 18 часов в условиях холодильника (+4 С). Через

18 часов в обе пробирки добавляли 1 мл 50 бычьей сыворотки, и смесь центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость отсасывали, а из осадков делали мазки, которые высушивали на воздухе, фиксировали этиловым спиртом

20 мин и окрашивали по Романовскому-Гимза. Просматривали под микроскопом 100 лимфоцитов, отмечая среди них лимфоциты, фиксировавшие на себе три и более эритроцита.

Заключение. При исследовании сыворотки крови больного заявляемым способом обнаружены антигела к инсулинорецепторам, так как сыворотка активировала лимфоциты донора и увеличивала число инсулиновых розеток в 3,7 раза (разведение 1:10) в 5 раз (разведение 1:20). На основе этих данных поставлен диагноз инсулинорезистентности иммунного генеза.

Пример 3. П-в И.И., 30 лет, практически здоровый донор. Объективно: нормальное телосложение. вес 64 кг. Язык чистый, Сердечно-сосудистая и дыхательная системы без особенностей. Живот мягкий, безболезненный. Содержание сахара в крови в норме. При исследовании сыворотки крови донора в две центрифужные пробирки забирали па 0,1 мл крови в 0,1 мл 5% свежеприготовленного раствора цитрата натрия.

После встряхивания содержимого пробирок в него вносили по 0,8 мл дистиллированной воды. а затем до 10 мл среду 199. Суспенэии клеток центрифугировали 5 минут при 1500 об/мин, после чего надосадочную жидкость отсасывали пипеткой. добавляли 1 л среды и снова центрифуги ровали при том же режиме. Отсосав надосадочную жидкость, осадок одной из пробирок соединяли с 0,1 мл исследуемой, декомплементированной, сывороткой крови донора. разведенной средой 199 1:10 или 1:20. Смесь осторожно встряхивали и инкубировали при температуре +37 С в течение 30 минут. После инкубации лейкоциты отмывали изотоническим раствором натрия хлорида путем центрифу1762241

Составитель А.Быкова

Техред М.Моргентал Корректор С.Юско

Редактор

Заказ 3257 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, yn,Ãàràðèíà, 101 гирования и отсасывали надосадочную жидкость. Затем осадки в обеих пробирках ресуспендировали в 0,1 мл изотонического раствора натрия хлорида рН 7,2. К полученным азаесям лейкоцитов добавляли. по 0,1 мл 5 взвеси зритроцитарного диагностикума, и смесь инкубировали при темперзтуре +37 С 10 минут, затем в течение 18 часов в условиях холодильника (+4 С). Через 18 часов в обе пробирки добавляли 1 мл 50 бычьей сыворотки,.и смесь центрифугировали при 1500 об/мин в течение 5 минут. Надосадочную жидкость сливали, а из осадков делали мазки, которые высушивали на воздухе, фиксировали этиловым спиртом 20 минут и окрашивали по Романовскому-Гимза.

Просматривали под микроскопом 100 лимфоцитов. отмечая среди них лимфоциты, фиксировавшие на себе три и более эритроцита.

В результате исследования установлено. что обработка лимфоцитов донора разведенной сывороткой крови здорового человека число инсулиноаых розеток прак.тически не изменяла (исходное число 9, после обработки сывороткой, раэаеденной

1:10 — 7-",ь, разведенной 1:20 — 4 ), Заключение: антител к инсулинорецепторам в крови донора нет.

Преимущества способа заключаются в его высокой специфичности и чувствительности, технической простоте исполнения и чтения его результатов. малом (0,1-0,2 мл) количестве крови, ззбираемой у больного из пальца. в необходимости минимальных ко личество доступных реактивов и несложного оборудования, что позволяет осуществлять проведемие способа в условиях клиники (больницы), в отсутствии необходимости привлечения высококвалифицированного

5 персонала для реализации способа. Выяснение генеза неэффективности инсулинотерапии, обусловленной разными иммунными факторами (антитела к инсулину, инсулиморецепторам и т.д,) представляет большой

10 практический интерес, являясь основой для рзционзльной гормонотерапии, иммуносупрессивного и других видов лечения.

Способ дает также возможность раннего выявления антирецепторных антител в

15 крови больного диабетом, что позволяет диагностировать начало развития имсулинорезистентности.

Формула изобретения

20 Способ определения инсулинорезистентности у больных сахарным диабетом I типа, включающий забор крови и ее исследование, о т,л и ч з ю шийся тем, что, с целью пс вышения точности способа, иэ кро25 ви выделяют сыворотку, разводят ее средой

199 в соотношении 1;10-20, инкубируют с лимфоцитами здорового человека при 37ОС в течение 30 мин, добавляют эритроциты барана. сенсибилизированные инсулином, 30 подсчитывают количество роэеткообраэующих клеток и при увеличении их количества в 3 и более раэ по сравнению с контролем определяют инсулинорезистентмоста имумного генезз.