Штамм бактерий bacillus coagulans - продуцент рестриктазы всо ai

 

Использование: биотехнология и в практике молекулярно-генетических и генноинженерных работ. Сущность изобретения: продуцент B.coagulans ВКМ В-732 выращивают при аэрации в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами . Биомасса B.coagulans ВКМ В-732 содержит новую сайт-специфическую эндонуклеазу BcoAl, узнающую и расщепляющую последовательность ДН К 5 С-А-С G-T-G 3, в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных количествах, содержание рестриктазы BcoAl в биомассе 6000-8000 ед/г сырой биомассы . Для изошизомера BcoAl, рестриктазы PmaCl, выход очищенного фермента 20 ед на 1 г сырого веса биомассы. Выход очищенного препарата эндонуклеазы рестрикции BcoAl составляет 700-1 200 ед. активности на 1 г сырой биомассы, что в 35-60 раз превышает известные цифры для рестриктазы PmaCl. Эндонуклеаза рестрикции BcoAl не содержит примесей фосфатаз, экзонуклеаз и неспецифических эндонуклеаз. oW Ё

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 N 9/16, 1/20

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

llO ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4896776/13 (22) 27,12.90 (46) 15.09.92, Бюл, № 34 (71) Институт биологической и медицинской химии АМН СССР и Институт молекулярной биологии им. В.А.Энгельрардта (72) H.Н.Соколов, Н.В.Аникейчева, M,А,Эльдаров, А.Б,Фицнер, И.В.Карпычев, А.А.Калугин, О.Т.Самко, Э,Б.Хорошутина и

Г.И.Либрик (56) Walker J.N.Â., Dean P.D.G., Saunders

J,R., Nucleic Acids Research, 1986, ч. 14, р.

1293 — 1301.

Roberts R.J„Nucleis Acids Research, 1988, ч, 16, р, r. 271 — 313.

Авторское свидетельство СССР

¹ 1170777, кл. С 12 N 9/14, 1983. (54) ШТАММ БАКТ Е Р И Й ВАС!LLUS

COAGULANS — ПРОДУЦЕНТ РЕСТРИКТАЗЫ ВСО Al (57) Использование: биотехнология и в практике молекулярно-генетических и генноинженерных работ. Сущность изобретения: продуцент В.coagulans ВКМ В-732 выращиИзобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано в молекулярно-генетических и генноинженерных работах.

Сайт-специфические эндонуклеазы (синонимы; рестриктазы II класса, эндонуклеаэы рестрикции) нашли широкое применение в качестве уникального инструмента исследования в молекулярном клонировании, структурных исследованиях ДНК, разработке подходов к диагностике наследственных заболеваний у человека, являются удобной моделью для изучения механизмов ДНКбелковых взаимодействий, Ы2, 1761804 А1 вают при аэрации в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами, Биомасса В.coaguians

ВКМ В-732 содержит новую сайт-специфическую эндонуклеазу BcoAI, узнающую и расщепляющую последовательность ДН К 5

С-А-С G-Т-G 3, в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных количествах, содержание рестриктазы

BcoAI в биомассе 6000 — 8000 ед/г сырой биомассы. Для изошизомера BcoAI, рестриктазы PmaCI, выходочищенного фермента 20 ед на 1 г сырого веса биомассы. Выход очищенного препарата эндонуклеазы рестрикции BcoAI составляет 700-1 200 ед. активности на 1 г сырой биомассы, что в

35 — 60 раз превышает известные цифры для рестриктазы PmaCI. Эндонуклеаза рестрикции ВсоА! не содержит примесей фосфатаз, экзонуклеаз и неспецифических эндонуклеаз.

К настоящему времени обнаружено и охарактеризовано более 1300 рестриктаз, одна из которых PmaCI выделена из

Pseudomonas maItophila СВ50Р /1/. Фермент гидролизует ДНК фага Л в 3 участках, аденовируса Ad2 в 10 и не расщепляет ДНК обезьяннего вируса SV40, ДНК фага Х174 и плазмиду pBR322 /2/, Содержание рестриктазы PmaCI в биомассе не указано, а выход очищенного препарата фермента составляет около 20 ед активности на 1 r биомассы.

Целью изобретения является получение штамма бактерий, продуцирующего новую

1761804 рестриктазу BcoAI со специфичностью 5 ...

С-А-С G-T-G ... 3 с высоким выходом фермента.

Поставленная задача достигается тем, что биомассу В,coagulans ВКМ В-732 выращивают при аэрации в питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, до поздней логарифмической фазы роста, целевой продукт выделяют из полученной биомассы известными методами, Рестриктаза BcoAI — изошизомер

PmaCI, узнает и расщепляет участок нуклеотидной последовательности ДН К 5 .„С-АС G-Т-G „. 3 . Фермент гидролизует ДНК фага А по 3 участкам, ДНК аденовируса Ad2 по 10 и не имеет сайтов узнавания на ДНК обезъяннего вируса SV40, ДНК фагаФ Х174 и плазмиде pBR322.

Поиск штамма продуцента проводили с использованием толуольного экспресс-метода тестирования рестриктазной активности в клетках микроорганизмов с последующим электрофоретическим разделением продуктов гидролиза ДНК в геле агарозы. Всего обследовано 48 штаммов, относящихся к родам Bacillus, Штамм В.coagulans ВКМ В-732 получен из Всесоюзной Коллекции Микроорганизмов АН СССР, где хранится под N BKM

В-732 - ССМ 101=IFOO 3557.

Характеристика штамма, Морфологические особенности. Клетки палочковидные, прямые или почти прямые, подвижны, образуют споры, Грамположительные.

Культурально-биохимические свойства.

На скошенном агаре рост по штриху обильный. На чашках Петри с мясо-пептонным

arapoM колонии крупные, матовые. На мясопептонном бульоне и бульоне Хоттингера равномерное помутнение, осадок. отношение к кислороду — строгий аэроб, Каталаза +, Индол -, На глюкозе — кислота+, газ —, Желатина уколом — разжижение, Оптимальные условия выращивания и хранения культуры.

Культура Bacillus coagulans BKM В-732 хорошо растет на твердых и жидких полноценных питательных средах: мясо-пептонном бульоне, среде LB, бульоне Хоттингера.

Оптимальные значения температуры и рН роста культуры находятся при 37 С и рН

7,2 — 7,4.

Наибольший выход биомассы, содержащей рестриктазу BcoAI, достигается при выращивании штамма-продуцента в

55 ферментере при 37 С в аэробных условиях на питательной среде Хоттингера, которая содержит в 1 л, 250 мл основного перевара

Хоттингера; 5 г NaCI; 1 г КгНР04 и до 1 л воды. Выращивание прекращают в конце логарифмической фазы роста, когда ростдостигает Авве=1,5 — 1,7. Выход биомассы 7 — 8 г/л.

На рыбной среде культура растет плохо (при 18-часовой ферментации на качалке

А650=0,3).

Ферментацию культуры проводят после добавления в ферментер инокулята в соотношении 1:10 к объему среды.

Рабочие культуры пересевают на мясопептонный бульон или среду Хоттингера один раз в 8-10 дней, Хранят культуру в полужидком мясопептонном агаре под вазелиновым маслом или в лиофилизированном виде в ампулах, Выделение рестриктазы BcoAI проводят фракционированием бесклеточных экстрактов двухфазной системе полиэтиленгликоль/декстран и хроматографией на колонках с ионообменниками.

Инкубационная смесь для определения активности рестриктазы BcoAI объемом 30—

50 мкл содержит: 0,01 М трис-HCI буфер, рН

7,5, 0,01 M МоСЬ, 0,1 М NaCI, 0001 М дитиотреитола, 100 мкгlмл бычьего сывороточного альбумина, 1 мкг ДНК фага А и 0,2-2 мкл фермента, Инкубацию проводят при 37

С в течение 60 мин. Продукты расщепления

ДНК фага А анализируют электрофоретически в 0,8 — 1 агарозном геле с последующим прокрашиванием геля в бромистом этидии. 3а единицу активности рестриктазы

BcoAI принимают количество фермента (в мкл), которое за 1 ч инкубации полностью гидролизует 1 мкг ДНК фага А при оптимальных условиях реакции.

Пример 1, Культуру В,coagulans ВКМ

В-732 предварительно адаптируют в течение ночи при 37 С в условиях аэрации на основной питательной среде, содержащей в

1 л: 250 мл основного перевара Хоттингера:

5 r NaCI; 1 г К2НРОд; до 1 л Н О. Инокулят для посева B ферментер готовят, пересевая адаптированную культуру на 1 л свежей среды из расчета 1:10 и размножают в условиях аэрации, Ферментацию культуры проводят после добавления в среду инокулята в соотношении 1:10 к объему среды в условиях аэрации при температуре 37 С, рН среды 7,2 — 7,4.

Во время выращивания рН культуральной жидкости поддерживают в пределах

7,0-7,6.

1761804

Пример 2. Культивирование штамма

В.coag ul an s В КМ В-732 проводят а налогично описанному в примере 1, за исключением того, что в качестве питательной среды используют среду В, которая содержит в 1

Составитель И.Привалова

Редактор В.Тоубченко Техред М.Моргентал Корректор Л.Ливринц

Заказ 3235 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина. 101

Выращивание продолжают до достижения конца логарифмической фазы роста.

Выход сырой биомассы составляет 7 — 8 г/л культуральной жидкости.

Содержание рестриктазы BcoAI в биомассе составляет 6000 — 8000 ед/г микробной массы, Выделение рестриктазы ВсоА!

10 r биомассы В.coagulans BKM В-732 суспендируют в буферном растворе, клетки разрушают ул ьтразвуком при температуре +

2 — 4 С и клеточную суспензию центрифугируют в течение 60 минут при 105 000 g. Осадок, содержащий клеточные оболочки и неразрушенные клетки, отбрасывают, а присутствующий в супернатанте фермент фракционируют в двухфазной системе полиэтиленгликоль/декстран, Обогащенную по рестриктазе

BcoAI верхнюю фазу хроматографируют в калий-фосфатном буфере в градиенте концентрации КС! на колонках с ДЭАЭ-сефарозой

С!=6В и с фосфоцеллюлозой Pll.

Получают 12000 ед, активности фермента в 2 мл буфера с 50 глицерином, Выход очищенного препарата рестриктазы ВсоА! составляет 1200 ед на 1 г сырого веса биомассы, Препарат фермента стабильно сохраняет активность в течение 9 — 12 месяцев при хранении при -20 С.

Фермент не содержит примесей фосфатаз, экзонуклеаз и неспецифических эндонуклеаз и пригоден для молекулярного клонирования и изучения структуры ДНК, r.; 10 г триптона; 10 г дрожжевого экстракта;

10 г NaCI; до 1 л воды, Выход биомассы 5-6 г/л культуральной жидкости.

5 После проведения очистки фермента, как описано выше, выход рестриктазы BcoAI составляет 700 — 900 ед. активности/г сырого веса биомассы, Таким образом, по предлагаемому спо10 собу получают новую эндонуклеазу рестрикции BcoAI.

Биомасса штамма B,coagulans ВКМ B-732 содержит новую сайт-специфическую эндонуклеазу BcoAI, узнающую и расщепляющую

15 нуклеотидную последовательность ДНК 5 ...

С-А-С G-T-G ... 3 в количествах, достаточных для получения рестриктазы в препаративных масштабах: содержание рестриктазы BcoAI в биомассе 6000 — 8000 ед/г, 20 Выход очищенной рестриктазы PmaCI, изошизомера BcoAI, 20 ед/г микробной массы.

Для рестриктгзы ВсоА! выход очищенного фермента составляет 700 — 1200 ед ак25 тивности на 1 г сырой биомассы, что в 35 — 60 раз превышает указанные цифры для рестриктазы PmaCI (50 ед), Эндонуклеаза рестрикции БсоА! не co— держит примесей фосф=-таз и неспецифиче30 ских нуклеаз.

Учитывая особенности строения участка узнавания рестриктазы BcoAI и его локализации на векторных молекулах ДНК, новый фермент может быть использован s

35 молекулярно-генетических и биотехнологических работах, Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus coagulans

ВКМ В-732 — продуцент рестриктазы Всо Al.