Способ диагностики клещевого энцефалита

 

Использование: в медицине, в частности в вирусологии, и касается диагностики клещевого энцефалита. Сущность изобретения: определяют в биологическом материа- .ле содержание РНК вируса клещевого энцефалита путем молекулярной гидридизации нуклеиновых кислот с ДНК - зондом, меченным радиоактивным фосфором и при его уровне 10 пг и более диагностируют клещевой энцефалит. Способ позволяет осуществлять раннюю диагностику и повысить его точность до 82%.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ntis G 01 N 33/48

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ ССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4861877/14 (22) 22.08.90 (46) 30.11.92. Бюл. М 44 (71) Омский научно-исследовательский институт природно-очаговых инфекций (72) Н.Д.Пиценко, 3.А.Кветкова, Л.П.Илюшенко, В,А.Шаманин и А.Г.Плетнев (56) Леденцова P.Þ. и др, Применение твердофазного иммунофлюоресцентного анализа для индикации вируса клещевого энцефалита. Арбовирусы Сб. тез. докл. пленума Всес. проблем. комиссии. Таллинн:

1984, с, 91-92.

Изобретение относится к медицине, в частности к вирусологии, и может быть использовано для диагностики клещевого энцефалита (КЭ). Известен способ вирусологической диагностики К3, основанный на выделении возбудителя из материала от больных с использованием чувствительных биологических систем и последующей его идентификации в серологических i реакциях с гипериммунными сыворотками.

Однако такой метод трудоемкий, продолжительный во времени и позволяет только ретроспективно подтверждать диагноз.

Известен также способ диагностики КЭ, основанный на определении вирусспецифических белков с помощью современных экспресс-методов: метода флюоресциру|ощих антител (МФА) и иммуноферментного анализа (ИФА). Однако, использование для диагностики КЭ МФА требует, как правило, предварительного накопления вируса в чувствительной биологической системе. К тому,,5LJ„„1778692 А1 (54) СПОСОБ ДИАГНОСТИКИ КЛЕЩЕВОГО

Э Н ЦЕФАЛИТА (57) Использование: в медицине, в частности в вирусологии, и касается диагностики клещевого энцефалита. Сущность изобретения: определяют в биологическом материа-. ле содержание PHK вируса клещевого энцефалита путем молекулярной гидридизации нуклеиновых кислот с ДНК - зондом, меченным радиоактивным фосфором и при его уровне 10 пг и более диагностируют клещевой энцефалит. Способ позволяет осуществлять раннюю диагностику и повысить его точность до 82ь. же метод трудно стандартизуем и не исключает получения ложноположительных результатов. Использование же ИФА ограничено из-за пригодности последнего для исследования крови больных, а также возможных ложноположительных результатов за счет взаимодействия ревматоидного фактора с.lg.Y человека и животных.

Цель изобретения; ранняя диагностика и повышение точности способа.

Для достижения поставленной цели способ предусматривает получение очищенных стандартизованных препаратов вирусной PHK из биологических проб от больных К3 (кровь) и последующее выявлеwe ее в реакции молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот с Р-меченными

ДН К-зондами.

Способ осуществляют следующим образом:

Из исследуемого клинического материала выделяют суммарные нуклеиновые кислоты. Наносят их на нитроцеллюлозный

1778692

55 фильтр, фиксируют отжигом и гибридизируют с меченным радиоактивным изотопом

Р зондом, содержащим фрагменты генома вируса КЭ штамма Софьин. Отгибридизованный фильтр экспонируют с рентгенавской пленкой. Содержание вирусной РНК в исследуемой пробе определяют полуколичественно, сравнивая интенсивность и размер засвеченных участков пленки со стандартными сигналами. При содержании

PHK вируса КЭ в исследуемой пробе 10 пг диагностируют КЭ, Пример конкретного выполнения изобретения.

Выявление РНК вируса КЭ из крови больных.

Кровь для исследования в количестве

500 мкл вносят в стерильную полипропиленовую пробирку с раствором натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА) до конечной концентрации 8 мМ с целью предотвращения свертывания крови.

Затем к пробе добавляют 500 мкл фенола, насыщенного 10 мМ раствором ацетата натрия до рН 5.2 и додецилсульфат натрия до содержания 0,5 мас.%. Смесь инкубируют на водяной бане в течение 15 мин при 60 С, периодически встряхивая, охлаждают 15 мин при -20"С, центрифугиоуют и отбирают

200 мкл водной фазы. Добавляют 20 мкл 3М раствора ацетата натрия (рН 5,2) до конечной концентрации 0,3 М, три объема перегнанного этилового спирта, встряхивают и осаждают PHK при -40 С в течение 1 ч. 3атем образцы центрифугируют при 800010000 об/мин, водноспиртовую фазу удаляют, а осадок llpoMblBBIoT спиртом и растворяют в 100 мкл стерильной дистиллированной воды. В пробирку помещают 20 мкл полученного раствора, добавляют 20 мкл 50 мМ фосфатного буферного раствора, содер>кащего параформальдегид (до 7,5% концентрации), прогревают на водяной бане при 55 С в течение.15 мин для денатурации нуклеиновых кислот. Затем пробирку охлаждают во льду, добавляют 40 мкл 5М раствора NaCI и наносят пробу на нитроцеллюлозный фильтр. Нуклеиновые кислоты фиксируют на фильтре прогреванием в вакуумном сушильном шкафу при 80 С в течение 2 ч. Отожженные фильтры помещают в гибридизационный раствор, содержащий

0,02% (вес/объем) фиколла-400, 0,02% (вес/объем), бычьего сывороточного альбумина, 0,02% (вес/объем) поливинилпирролидона, 100 мкг/мл денатурированной при

100 С в течение 5 мин ДНК быка, а также

100 мкг/мл денатурированной суммарной

РНК дрожжей, 0,5% додецилсульфата натрия, 0.09М цитрата натрия в 0,9М NaCI (рН

7,0). Гибридизационный раствор используют из расчета 0,5 мл на 1 см фильтра. инкубируют 2 ч при 65 С, а затем добавляют 50 нмlмл денатурированного зонда (P-Мезг ченная кДНК-ВКЭ) и инкубируют12-18ч при

65 С. После этого фильтры отмывают в растворе, содержащем 0,015М цитрата натрия в 0,15 М NaCI рН 7,0, при 55 С трижды по 30 мин. Фильтры сушат при комнатной температуре и экспонируют с рентгеновской пленкой РМ-1 или РТ-1 ("Тасма") в течение

4-24 ч, которую затем проявляют.

В качестве положительного контроля используют ДНК рекомбинантной плазмиды, несущей ДНК-копии (кДНК) генома вируса КЭ штамма Софьин в количестве 1000 пг, 100 пг, 10 и 1 пг. Отрицательными контролями служат дрожжевая РН К и ДН К быка, каждая в количестве 1 мкг в пятно, а также

РНК, выделенная из донорской крови. Результаты реакции оценивают визуально, сравнивая интенсивность и размер пятен в образцах со стандартами. Положительными считают пробы, интенсивность сигнала которых 10 пг кДНК вируса КЭ, < 1 пг— отрицательными, а 1-10 пг — слабоположительными. В последнем случае обследование повторяют. Содержание в крови 10 пг

РНК вируса считают диагностически значимым.

Предлагаемый способ апробирован на

400 пробах крови, полученных от 123 больных. Использование гибридизационного анализа для индикации РНК вируса КЭ в пробах крови больных с разным клиническим течением заболевания позволило при многократном их обследовании подтвердить диагноз в 82% случаев, в то время как при анализе с помощью биопробы — в 53%.

Положительный эффект — усовершенствование лабораторной диагностики КЭ. Высокая специфичность способа исключает необходимость дополнительной вирусологической идентификации, в связи с чем использование предлагаемого способа позволяет обеспечить экспрессную и раннюю диагностику КЭ. Способ, ориентированный на раннее выявление возбудителя, позволяет оптимизировать тактику лечебных ероприятий.

Формула изобретения

Способ диагностики клещевого энцефалита путем исследования биологического материала, отл ича ю щи и с я тем,что, с целью ранней диагностики и повышения точности способа, в крови опредег:яют содержание PHK вируса клещевого энцефалита путем молекулярной гибридизации

1778692

Составитель Н. Пиценко

Редактор Т. Полионова Техред М.Моргентал Корректор Н. Бучок

Заказ 4190 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва. Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 нуклеиновых кислот с ДНК-зондом, меченым радиоактивным фосфором, и при его уровне 10 пг и более диагностируют клещевой энцефалит.