Способ идентификации возбудителя брюшного тифа

 

Использование: микробиология, идентификация энтеробактерий, бактериологическая диагностика. Сущность изобретения: на комбинированных 2 и 3 сахарных средах дополнительно отбирают лактозоположительные. не образующие газ и сероводород культуры. Пересевают их на скошенную со столбиком лактозную среду, содержащую (г/л): агар 8,9; пептон 2-3; углевод 10-15; натрия хлорид 4-5; калия дигидрофосфат 0,3-0,4; натрия тиосульфат 0,2-0,3, бромтимоловый синий (0,2%-ный водный раствор) 11-12 мл, вода дистиллированная до 1 л, рН 7,2-7,4. Инкубируют посевы 24-72 ч при 37°С, отбирают культуры, дающие лактозоотрицательную реакцию, пересевают их на дифференцирующий биохимический ряд,- определяют серологические и фаголизабельные свойства и индентифицируют культуры по совокупности признаков, характерных для бактерий брюшного тифа. Способ дает возможность выявлять ранее не диагносцируемую известным способомзначительную группу типичных бактерий брюшного тифа с несколько сниженной в пределах естественной вариабельности активностью протеолитических ферментов и фермента тиосульфатредуктазы. 5 табл. (Л С

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)5 С 12 Q 1/04

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОспАтент сссР) . J

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ.1 (21) 4908092/13 (22) 27.11.90 (46) 15.12.92. Бюл. М 46 (71) Районная санэпидстанция, r. Пролетарск Ростовской области (72) И. М. Подплетенная (56) Методические указания по микробиоло. гической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями, M., 1984, с. 24-35. (54) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИЙ ВОЗБУДИТЕЛЯ БРЮШНОГО ТИФА (57) Использование: микробиология, идентификация энтеробактерий, бактериологическая диагностика. Сущность изобретения: на комбинированных 2 и 3 сахарных средах дополнительно отбирают лактозоположительные, не образующие газ и сероводород культуры. Пересевают их на скошенную со столбиком лактозную среду, содержащую

Изобретение относится к микробиологии и может быть использовано при идентификации энтеробактерий.

Известен классический способ идентификации возбудителя брюшного тифа, выбранный нами за прототип (Методические указания по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями).

Способ осуществляется путем посева исследуемого материала на среды обогащения с последующим пересевом на селективные йластинчатые среды. посевом выросших лактозоотрицательных колонйй на 2-или 3-сахарные комбинированные среды и идентификацией культур по совокупноЫЛ,, 1781299 А1

2 (г/л): агар 8,9; пептон 2-3; углевод 10 — 15; натрия хлорид 4 — 5; калия дигидрофосфат

0,3-0,4; натрия тиосульфат 0,2-0,3, бромтимоловый синий (0,27;-ный водный раствор)

11-12 мл, вода дистиллированная до 1 л, рН 7,2-7,4. Инкубируют посевы 24-72 ч при

37"С, отбирают культуры, дающие лактозоотрицательную реакцию, пересевают их на дифференцирующий биохимический ряд,определяют серологические и фаголизабельные свойства и индентифицируют культуры по совокупности признаков, характерных для бактерий брюшного тифа.

Способ дает возможность выявлять ранее не диагносцируемую известным способом. значительную группу типичных бактерий брюшного тифа с несколько сниженной в пределах естественной вариабельности активностью протеолитических ферментов и фермента тиосульфатредуктазы. 5 табл.

Ф сти биохимических, серологических и фаголизабельных свойств.

Недостатком данного способа является невозможность диагностировать значительную группу типичных бактерий брюшного тифа с несколько сниженной в пределах естественной вариабельности протеолитической активностью фермента тиосульфатредуктазы, дающих на комбинированных средах ложноположительную оценку лактозного признака и ложноотрицательную — признака продукции сероводорода.

Целью изобретения является повышение точности способа.

1781299 до1л

7,2-7,4

Цель достигается путем дополнительного отбора из комбинированных средах лактозоположительных, не образующих газ и сероводород культур, пересева на скошенную со столбиком лактозную среду, содержащую, г/л:

Агар 8-9

Пептон 2-3

Углевод 10-15

Натрия хлорид 4-5

Калия дигидро. фосфат 0;3-0,4

Натрия тиосульфат 0,2-0;3

Бромтимоловый синий (0,2 водный раствор) 11-12

Вода дистиллированная до I ë рН . " 7,2-7,4. инкубирования посева при 37 С (24-72 ч), пересева культур, учтенных на предЛоженной среде как лактозоотрицательные, на среды биохимического ряда; в котором сахаролитические свойства определяют на скошенных со столбиком моноуглвводных средах (маннит, сахароза, дульцит, арабикоза и др.), а признак образования сероводорода на среде типа Клиглера при культивировании при 37 С не менее 4-5 суток с ежедневным контролем, определения серологических и фаголизабельных призна ков и идентификации культуры йо совокупности признаков, характерных для

Salmonella typhi. . Пример 1. Исследуемый материал засевают в среды накопления, инкубйрУют в течение 18 — 24 часов при 37ОС. Пересевают на пластинчатые селективные среды. Культивируют при 37ОС в течение 20-24 часов.

Выросшие лактозоотрицательные колонии пересевают на 2-х или 3-х сахарные комбинированные, среды тйпа Клиглера. Культивируют при 37 С в течение суток. Отбирают лактоэоположительные, не образующие газ и сероводород культуры и пересевают их на скошенную со столбиком" лактозйую питательную среду, содержащую, г/л:

Агар - 8-9

Пептон . 2-3

Углевод 10-15

НаТрия Млорид 4-5

Калия дигидро- фосфат 0,3-0,4

Натрий тиосульфат 0,2-0,3

Бромтимоловый синий (0,2 $-ный водный раствор) 11-12

Вода дистилли-— рованная рН мл, стерилизуют при 0,5 избыточной атмосферы при 112 С в течение 20 мин. После стерилизации пробирки оставляют в слегка наклонном положении для получения "ско30 шенного столбика". В готовом виде среда имеет травянистый цвет.

Применение среды: Испытуемую культуру засевают штрихом по скосу и уколом в столбик среды. После культивирования при

35 37 С в течение суток производят учет теста.

В зависимости от степени активности определяемого сахаролитического фермента к моменту учета возможны следующие варианты:

40 При высокой степени активности — среда в скосе и в столбике; колонии на скосе окрашиваются в желтый цвет.

При средней степени активности — в желтый цвет окрашиваются лишь колонии

45 на скошенной части среды.

При слабой степени активности в случае замедленной ферментации среда сохраняет зеленую окраску и окончательно тест следует учесть через 48-72 часа.

50 Иэ данных табл. 2 видно, что у некоторых испытуемых культур ферментация углеводов (лактозы) происходит только в относительно анаэробных условиях столбика среды. В этом случае тест оценивают как

55 положительный при переходе окраски в столбйке среды из зеленой в ярко- желтую при одновременном появлении синей окраски в скошенйой части, Гаэообразование учитывают в столбике по появлению пузырьков, разрывов среды.

Посевы инкубируют 24-72 ч при 37ОС, отбирают лактозоотрицательные культуры, засевают их на биохимический ряд, в котором расщепление маннита, сахарозы, ксилозы, арабинозы, дульцита, сорбита определяют посевом на скошенные со столбиком моноуглеводные среды, а продукцию сероводорода инкубированием культуры на среде Клиглера с ежедневным контролем не менее 4-5 сут. Определяют серологические и фаголизабельные признаки и идентифицируют культуру по совокупности всех признаков.

Пример 2. Приготовление моноуглеводной скошенной со столбиком среды.

Навеску хлорида натрия, углевода, пептона и двухэамещенного фосфата калия, гипосульфита предварительно растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды. В оставшейся дистиллированной воде при помешивании и подогревании до закипания растворяют агар. Затем все ингредиенты соединяют, перемешивают и добавляют индикатор. Устанавливают рН=7,2 — 7,4. Разливают в пробирки по 7 — 8

1781299

Энтеробактерии, не расщепляющие со- Из данных табл.1 видно, что оптимальответствующий углевод, окрашивают скос ным является следующий состав среды, г/л: среды в синий цвет за счет образующихся в Агар 8-9 небольшом количестве щелочных продук- Пептон 2-3 тов протеолиза. более интенсивно протека- 5 углевод 10-15 ющего в аэробных условиях скоса. Натрия хлорид 4-5

Сохранение зеленой окраски или слабое не- Калия дигидрофосфат 0,3-0,4 специфическое пожелтение столбика при . Натрия тиосульфат 0,2-0,3 одновременном окрашиаании скоса среды бромтимоловый в синий цвет оценивают как отсутствие со- 10 синий (0,2 водный ответствующего фермента у испытуемых раствор) 11-12 бактерий. Вода дистиллированная До 1 л

Пример 3. Среда с минимальными рН 72-74 значениями ингредиентов. Уменьшение концентрации ингредиенСреду готовят по примеру 2. Получен- 15 товнеблагоприятнодляжизнедеятельности ная среда имеет следующий состав, г/л: и выявления ферментативных способнос ей т

8 микробов, Увеличение концентрации ингре2 диентов ведет к черезмерному осмотическоЛактоза 1.0 му давлению в среде, что также затрудняет

Натрия хлорид 4 20 жизнедеятельность и выявление ферментаНатрия тиосульфат 0,2 тивной пособности микроорганизмов.

Калия дигидрофосфат 0,3 Из сравнительных данных табл. 2, 3 на

Бромтимоловый приме: е определения расщепления лактосиний (0,2 водный зы на ;реде Гисса с лактозой, среде Клиглераствор) 11 25 ра и предлагаемой скошенной среде с

Вода дистиллированная До 1 л лакто::;ой видно, что последняя обладает нарН 7,2-7,4 ибол .-.шей чувствительностью.

Данные по идентификационным свой- Из данных табл. 3 видно, что для ферствам с е ысм. вта л р д см. в табл, 1. — ментации углеводов (лактозы) у некоторых

Пример 4. Среда с оптимальнйми 30 энтеробактерий имеет значение степень значениями ингредиентов; — анаэробности условий. Для доказательства . реду готовят по примеру 2. Получен- этого положения испытуемйе культуры, учАга ная среда имеет следующий состав, г/л; тенные на среде Клиглера как лактозоо рт и8,5 цательные, пересевают для оценки ,2,5 35 лактозного теста на скошенную со столби12,5 . ком агаризованную среду Гисса с лактозой ..:.Натрия хлорид 4,5 (r. Махачкала НИИ по производству питаТиосульфат натрия 025 тельных сред) и скошенную со столбиком

Калия дигидрофосфат 0.35 лактозовую среду. ромтимоловыи 40 Пример 6, Сравнительная оценка синий(0,2 $-.íûé водный:: ферментации лактозы на средах Клиглера, раствор) 11,5 Гисса и скошенной лактозной среде(табл.2).

Вода дистиллированная до 1 л Пример 7. Влияние на метаболизм р Н 7,2-7,4 лактозы аэробных (скос среды) и относиДанные по идентификационным свой- 45 тельно анаэробных условий (столбик с ествам среды см. в табл. 1. ды) (табл.3), P

Для сохранения форм "скошенный столПример 5. Среда с максимальными бик" в среду Гисса при приготовлении дозначениями ингредиентов. бавляют в количестве 8 г/л агар.

Среду готовят по примеру 2. Получен- 50 Основываясь на полученных данных, ная среда имеет следующий состав(г/л):, представленных в таблице 2 и 3, можно

Ага

Пептон . 9 утверждать, что использование скошен- .

3 ной со столбиком моноуглеводной. среды

15 позволяет более достоверно определить

Натрия хлорид . 5 55 расщепление углеводов при вариабельной

0,3 активности соответствующего фермента, Калия дигидрофосфат 0,4 получить полуколичественную оценку теста

Бромтимоловый синий:- 12 и определить ферментативный (в относиВода дистиллированная До 1 л тельно анаэробных условиях столбика) и рерН 7,2-7,4

1781299 спираторный (в условиях скошенной части) характер утйлизации углеводов.

Более чем семикратная разница в концентрации углевода и пептона позволяет избежать маскирующего влияния щелочных продуктов протеолиза и создать преимущественные условия для образующихся кислых продуктов расщепления углеводов, Пример 8. Влияние срока экспозиции

-на продукцию сероводорода у штаммов S. урЫ на среде Клйглера.—

Пример 9. Влияние срока экспозиции на эащелачиванйе скошенной части Клиглера при культивировании S. турЫ.

Таким образом срок экспозиции культур S. typhi на средах типа Клиглера в 4 — 5 сут является оптимальным, т.к. он достаточен для вьгявления признака образования сероводорода. Уменьшение срока, ведет к ложноотрицательной оценке признака образования сероводорода; увеличение экс. позиции может привести к гибели культуры.

Пример 10. У больного В., у которого при оперативном вмешательстве установлена перфорация кишечника с прозрением на брюшнотифозную этиологию, была взята проба крови в количестве 12 мл. Произведен посев в 150 мл желчного бульона, Через 48 часов инкубации при 37 С был произведен высев из желчного бульона на среду Энда.

Через 18 часов инкубирования при 37 С на среде Эндо выросли мелкие бесцветные колонии, которые были пересеяны на комбинированную дифференциальную среду

Олькельницкого, Через 24 часа инкубйрования при 37 С на скосе среды выросли мелкие изолированные колонии. Скос и столбик среды изменили розовую окраску на желтую, газообразование и продукция сероводорода отсутствовали. Культуры были оценены как ферментирующие глюкозу, лактозу, не продуцирующие газ и сероводород и не подлежащие дальнейшему исследованию согласно общепринятой схеме классического способа.

Культуры были пересеяны"на скошенную со столбиком лактозную среду. см. пример 1. Через 24 ч инкубирования при 370С культура была оценена как лактозоотрица- тельная (см. пример 2) и пересеяна на среду

Олькельницкого и среды. биохимического дифференцирующего ряда, в котором оценка теста расщепления углеводов производилась на скошенных со столбиком углеводных средах с соответствующими углеводами (маннит, сахароза, дульцит, ксилоза, арабиноза, сорбит, рамноза).

Через 72 ч инкубирования культуры на среде Олькельницкого отмечалось защелачивание скошенной части среды и продуцирование сероводорода.

После оценки тестов на средах дифференцирующего ряда культуры были оценены как неферментирующие лактозу, сахарозу, дульцит, рамнозу, ферментирующие глюкозу, ксилозу, арабинозу, маннит, сорбит, декарбоксилирующие лизин, не образующие индол, не утилизирующие цитрат и малонат

10 натрия, продуцирующие сероводород, по15

50 движные грамотрицательные палочки, агглютинирующиеся сальмонеллезной сывороткой 09 и Vi, Hd, лизирующиеся брюшнотифозным бактериофагом.

По совокупности этих признаков они были идентифицированы как бактерии брюшного тифа, что нашло подтверждение после повторной идентификации в Ростовской-на-Дону областной баклаборатории, где выделенная культура была отнесена к фаговару Е i, второму ферментативному типу.

Указанный пример иллюстрирует вероятность диагностической ошибки при использовании комбинированных сред и повышение точности исследования при применении предложенного способа, Пример 11. Проба мочи в количестве

50 мл доставлена.в лабораторию при обследовании Н, общавшегося с больным В.

Был произведен прямой посев на среду

Плоскирева, Эндо. Через 20 ч на этих средах выросли мелкие бесцветные колонии, которые были пересеяны на среду Клиглера, инкубировались при 37 С. Через 24 ч снятые культуры были оценены как лактозоположительные, не образующие газ и сероводород.

Культуры были пересеяны на лактозную скошенную со столбиком среду и культивировались при 37 С в течение 24 ч и были оценены как лактозоотрицательные. Культуры были вновь пересеяны на среду типа Клиглера (предприятие центрального НИИВС им. И.

И. Мечникова) и среды биохимического дифференцирующего ряда, Через 48 часов инкубирования на среде Клиглера отмечалось защелачивание скоса среды и продукция сероводорода.

По результатам испытания на средах дифференцирующега ряда, включая скошенные со столбиком моноуглеводные среды, культуры по совокупности биохимических, серологических и фаголизабельных признаков были оценены как брюшнотифозные. После повторной идентификации в Ростовскойна-Дону областной баклаборатории культура была отнесена к фаговару Е, второму ферментному типу.

Пример 12, Проба испражнений больного энтероколитом в количестве 1 г

1781299

10 была засеяна в селенитовый бульон на чашки со средой Плоскирева и Эндо. Через 20 часов инкубации при 37 С на среде Эндо и

Плоскирева выросли мелкие бесцветные колонии, которые были пересеяны на среду типа Клиглера. Культуры культивировались при 37 С 24 ч и были учтены как лактозоположительные, не образующие газ и сероводород, и пересеяны на скошенную со столбиком лактоэную среду. Через 24 ч культивирования при 37 С культура была учтена как лактозоположительная и не подлежащая дальнейшей идентификации на бактерии брюшного тифа.

Этот пример иллюстрирует, что в дан. ном случае оценка лактозного теста на среде Клиглера была достоверной., Таким образом, использование предлагаемого способа дает возможность выявлять путем дополнительного отбора на 2-и 3-сахарном агаре лактозоположител ьных, не образующих газ и сероводород культур, и пересева их на лактозную скошенную со столбиком питательную среду, ранее не диагносцируемую значительную группу бактерий брюшного тифа и назначить соответствующее этиотропное лечение и провести своевременно необходимые противоэпидемические мероприятия.

Формула изобретения

Способ идентификации возбудителя брюшного тифа путем посева исследуемого

Таблица 1

Данные по идентификационным свойствам среды

Количество штаммов

Учтены как лактоэоположительные на с е ах:

Род испытуемых энтеробактерий

С максимальным значением ингреиентов

С оптимальным значением ингреиентов

С минимальным значением ингреиентов

Гисса

Клиглера

21

11

22

26

12

24

0

0

12

0

44

26

12

12

Citrobacter

Entегоbacter.

Salmonella

К!еЬз1еИа

Sh. sonne

Таблица 2

Количество культур скошенной:

-Гисса: абс абс и о ент и о ент

82,9

82,9

477

577

575

17,2

86

55,4

277

500

Группа культур по характеру роста на среде Клиглера

Лактозопоэитивные, не продуцирующие газ и сероводород, в т.ч. идентифицированные как

S. турЫ

Лактозонегативные, газообразующие, не продуцируюиесе оао о о материала на среды обогащения с последующим пересевом на селективные пластинчатые среды, пересевом выросших лактозоотрицательных колоний на двух--или

5 трехсахарные среды и идентификацией культур по совокупности биохимических,.серологических и фаголизабельных свойств, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, дополнитель10 но отбирают на комбинированных средах первичной идентификации лактоэоположительные, не образующие газ и сероводород культуры, пересевают на скошенную со столбиком лактоэную среду, содержащую, 15 г/л:

Агар 8-9

Пептон 2 — 3

Углевод 10-15

Натрия хлорид 4-5

20 Калия дигидрофосфат 0,3-0,4

Натрия тиосульфат 0,2-0,3

Бромтимоловый синий

0,2-ный водный раствор 11 — 12

Вода дистиллированная до 1 л

25 рН 7,2-7,4, инкубируют в течение 24-72 ч, отбирают лактозоотрицательные культуры, определяloT сахаролитические свойства на скошенных со столбиком моноуглеводных средах, а

30 продукцию сероводорода — на средах типа

Клиглера в течение 24-120 ч.

Учтены как лактозоположительные на с е ах:

1781299

Проодолжение табл.2

Количество культур

Группа культур по характеру роста на среде Клиглерэ

Гисса: скошенной: абс. абс. процент процент

О

О.

О

222

О :

57,7

128

446

0,69

22

572

0

0

0

664

372

2085. 4

68

954

1,1

34

45,8

О

О

31,7

477

31,5

185

12,2

Таблица 3

Характер роста на среде Клиглера

Кол-во культур

Гисса: лактозной: по кислотоо6. в скосе и столбике всего по кислотооб. в столбике всего по кислотооб. в скосе и столбике по кислотооб. в столбике

Лактозоотрицательные, газообразующие, проду ци рующи е сероводород

Лактозоотрицательные, газообразующие, не продуцирующие сероводород

Всего

222

128

147

49

17

369

194

148

127

46

Таблица 4

Лактозонегативные, не продуцирующие газ и продуцирующие сероводород, в т.ч. идентифицированные как Salmonella

?урЫ

Л актозонегативн ые, газообразующие, продуцирующие сероводород, в т.ч. идентифицированные как

Salmonella

Лактозонегативные, не продуцирующие газ и сероводород, в т.ч. идентифицированные как $Ыцейа

Неферментирующие

Всего испытано культур, в т.ч. лактозонегативных по оценке на комплексной среде

Учтены как лактозоположительные на с е ах:

Учтены как лактозоположительные на с е е

1781299

Таблица 5

Появление за елачивания в с оки, ч

48

72 ..96

120

12 6 1

Редактор

Заказ 4256 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, ул.Гагарина. 101

Количество штаммов

Составитель И. Подплетенная

Техред М.Моргентал Корректор Н. Гунько