Способ получения препарата для лечения язвенной болезни желудка
Использование: биотехнология, терапия и профилактика язвенной болезни желудка. Сущность изобретения: гриб Fusarium Sambucinum штамм BKMF-3051 Д выращивают методом глубинного культивирования на жидкой питательной среде, содержащей мелласу, сахарозу, аммоний азотнокислый и фосфорнокислый калий однозамещенный. После культивирования культуральную жидкость отделяют от биомассы и экстрагируют липиды хлороформом. Из биомассы липиды экстрагируют этанолом и хлороформом трехкратно. Растворители упаривают, а осадок растворяют в подсолнечном масле и получают продукт следующего состава, мас.%: простагландин E2 и его эфиры 0,039 - 0,073, простагландин F2
и его эфиры 0,031 - 0,057, фосфолипиды 0,25 - 1,00, подсолнечное масло до 100.
Изобретение относится к технологии физиологически активных веществ и может найти применение в медицинской промышленности при получении препаратов против язвенной болезни желудка. Для лечения язвенной болезни желудка в третьей стадии клинических испытаний находятся препараты синтетических аналогов простагландинов различных зарубежных фирм - арбапростил, мизопростол, энпростил, ноклопрост, тримопростил, розапростил. Однако все эти препараты имеют побочные действия: повышение температуры тела, тошноту и диаррею. Известен способ получения состава для стимуляции репаративных процессов, содержащего природные простагландины и фосфолипиды, заключающийся в выращивании гриба Fusarium sambucinum штамма BKMF-3051 Д методом глубинного культивирования на жидкой питательной среде и выделении липидов экстракцией органическими растворителями с последующим концентрированием и растворением липидов в подсолнечном масле до концентрации суммы простагландинов 0,005%. Недостатком указанного способа является низкий выход целевого продукта. Кроме того, состав получаемый по известному способу, при пероральном введении мало эффективен для лечения язвенной болезни желудка. Целью изобретения является увеличение выхода целевого продукта. Указанная цель достигается тем, что гриб Fusarium sambucinum штамм BKMF-3051 Д выращивают методом глубинного культивирования на жидкой питательной среде следующего состава, г/л: меласса 20 - 30, сахароза 20 - 25, аммоний азотнокислый 3 - 4, калий фосфорнокислый однозамещенный 2 - 5. Целевой продукт содержит природные простагландины, их производные и фосфолипиды, использование которых не дает побочных эффектов при лечении язвы желудка у экспериментальных животных. Сущность изобретения состоит в том, что гриб Fusarium sambucinum штамм BKMF-3051 Д выращивают в ферментаторе объемом 100 л на среде следующего состава, г/л: меласса 20 - 30, сахароза 20 - 25, аммоний азотнокислый 3 - 4, калий фосфорнокислый однозамещенный 2 - 5, при 26oC с перемешиванием мешалкой со скоростью 210 об/мин и аэрацией 1 л/л
мин в течение 35 - 48 ч. Биомассу и культуральную жидкость разделяют путем фильтрования на нутч-фильтре. Биомассу заливают двукратным количеством 96%-ного этанола (масса/объем) и выдерживают при комнатной температуре в течение 17 - 20 ч. Затем биомассу отделяют от водно-спиртового раствора фильтрованием, водно-спиртовой экстракт упаривают в вакууме до воды при температуре не выше 45oC. Водный остаток подкисляют 2 н. соляной кислотой до pH 4,0 - 4,5 и трижды экстрагируют хлороформом по 1/3 от объема. Объединенные хлороформные экстракты промывают небольшим количеством воды и упаривают досуха в вакууме при температуре 40oC. Биомассу же после первой экстракции заливают 82%-ным этанолом в соотношении 1: 2 и настаивают в течение 7 дней, фильтруют, после чего повторяют вышеописанные операции обработки фильтрата. Также обрабатывают биомассу третий и четвертый раз. Все экстракты после 4 обработок биомассы этанолом, упаренные досуха до маслообразного состояния, объединяют. Культуральную жидкость трижды экстрагируют хлороформом после подкисления до pH 4,0 - 4,5. Хлороформные экстракты объединяют и упаривают в вакууме при 40oC. Полученные липиды из всех экстактов объединяют и анализируют на содержание простагландинов известными методами: для ПГЕ2 методом УФ-спектрофотометрии и для ПГF2 методом ГЖХ. На основании полученных данных анализа растворяют липиды в подсолнечном масле для получения состава, мас.%: простагландин Е2 и его эфиры 0,039 - 0,073, простагландин F2 и его эфиры 0,031 - 0,053, фосфолипиды 0,25 - 1,00, подсолнечное масло до 100. Предлагаемый способ имеет преимущество в том, что позволяет повысить выход целевого продукта в 4 раза и получить состав для лечения язвенной болезни желудка. Состав применяется перорально 5 г (одна чайная ложка) 1 раз в день в течение 5 дней. Заживление язвы у экспериментальных животных происходит так, что к 15 - 21 дню в месте нахождения язвы клетки имели нормальное строение, рубец отсутствовал. Кроме того, отмечалось отсутствие побочного действия от применения указанного состава. Пример 1. Гриб Fusurium sambucinum штамм BKMF-3051 Д выращивают в условиях прототипа методом глубинного культивирования на жидкой питательной среде, содержащей, %: сахароза 4, мочевина 0,3, калий фосфорнокислый двузамещенный 0,15, калий фосфорнокислый однозамещенный 0,1, магния сульфат 0,05, цинка хлорид 0,01, в ферментаторе с рабочим объемом 70 л, при температуре 26oC, pH 6,0 в течение 40 ч. Инкубат заливают этанолом в соотношении 1 : 6, настаивают при перемешивании в течение 48 ч. Экстракт отделяют на пресс-фильтре, упаривают в вакууме при температуре 40oC. Водный остаток подкисляют до pH 4,0 и трижды экстрагируют хлороформом. Объединенные экстракты упаривают, а остаток растворяют в масле, получают 210 г состава, мас.%: простагландин Е2 и его эфиры 0,067, простагландин F2 и его эфиры 0,033, фосфолипиды 0,85, подсолнечное масло до 100. Пример 2. Гриб Fusurinum sambucinum штамм BKMF-3051 Д выращивают методом глубинного культивирования на жидкой питательной среде, содержащей, г/л: меласса 25, сахароза 23, аммоний азотнокислый 3,5, калий фосфорнокислый однозамещенный 3, в ферментаторе с рабочим объемом 70 л, при температуре 26oC, pH 6,0 в течение 40 ч, аэрацией 1 л/лмин и при перемешивании со скоростью 210 об/мин. Биомассу и культуральную жидкость разделяют путем фильтрования на нутч-фильтре. Биомассу заливают двукратным количеством 96%-ного этанола (масса/объем) и выдерживают при комнатной температуре в течение 20 ч. Затем биомассу отделяют от водно-спиртового раствора фильтрованием, водно-спиртовой экстракт упаривают до воды в вакууме при температуре не выше 45oC. Водный остаток подкисляют 2 н. соляной кислотой до pH 4,0 - 4,5 и трижды экстрагируют хлороформом по 1/3 от объема. Объединенные хлороформные экстракты промывают небольшим количеством воды и упаривают досуха в вакууме при температуре 40oC. Биомассу же после первой экстракции заливают 82%-ным этанолом в соотношении 1:2 и настаивают в течение 7 дней, фильтруют, после чего повторяют вышеописанные операции обработки фильтрата. Так обрабатывают биомассу третий и четвертый раз. Все экстракты после 4 обработок биомассы этанолом, упаренные досуха до маслообразного состояния, объединяют. Культуральную жидкость трижды экстрагируют хлороформом при pH 4,1. Хлороформные экстракты объединяют и упаривают в вакууме при 40oC. Полученные липиды из всех экстрактов объединяют и растворяют в подсолнечном масле. Получают 840 г состава, мас. %: простагландин E2 и его эфиры 0,067, простагландин F2 и его эфиры 0,033, фосфолипиды 0,85, подсолнечное масло до 100. Пример 3. Гриб Fusurium sambucinum штамм BKMF-3051 Д выращивают методом глубинного культивирования на жидкой питательной среде, содержащей, г/л: меласса 20, аммоний азотнокислый 3, сахароза 20, калий фосфорнокислый 2, в условиях, описанных в примере 2. Выделение липидов проводили, как описано в примере 2. Получают 811 г состава, мас.%: простагландин E2 и его эфиры 0,039, простагландин F2 и его эфиры 0,057, фосфолипиды 0,25, подсолнечное масло до 100. Пример 4. Гриб Fusurium sambucinum штамм BKMF-3051 Д выращивают методом глубинного культивирования на жидкой питательной среде, содержащей, г/л : меласса 30, сахароза 25, аммоний азотнокислый 4, калий фосфорнокислый однозамещенный 5, в условиях, описанных в примере 2. Выделение проводят так же, как описано в примере 2. Получают 843 г состава, мас.%: простагландин E2 и его эфиры 0,073, простагландин F2 и его эфиры 0,031, фосфолипиды 1,0, подсолнечное масло до 100. Пример 5. Гриб Fusurium sambucinum выращивают методом глубинного культивирования на жидкой питательной среде, содержащей, г/л: меласса 25, сахароза 22,5, аммоний азотнокислый 3,5, калий фосфорнокислый однозамещенный 3,5, в условиях, описанных в примере 2. Выделение липидов и приготовление состава проводят, как описано в примере 2. Получают 847 г состава, мас.%: простагландин E2 и его эфиры 0,073, простагландин F2 и его эфиры 0,031, фосфолипиды 0,25, подсолнечное масло до 100. Пример 6. Опыты проводили на 40 белых беспородных крысах-самцах весом около 250 г. У всех животных создавали модельную язву желудка путем прожигания стенки желудка уксусной кислотой через адвентицию. По этой методике на пятые сутки происходил полный некроз всех слоев стенки желудка, секвестрация этого участка, образовалась язва. Лечение начинали производить на шестые сутки после начала эксперимента. Животных делили на 2 группы (по 20 штук). Первой группе ежедневно в течение 4 дней вводили внутрижелудочно по 0,5 мл состава в разведении 1:100, второй группе (контрольной) идентичным образом вводили по 0,5 мл подсолнечного масла. Результаты заживления язв оценивали микроскопически и методами гистологии на 4, 7, 10, 15 и 21 сутки после начала лечения. Обнаружен положительный эффект при лечении язв исследуемым составом. У животных опытной группы с седьмого, а у некоторых уже с четвертого дня лечения отмечалось сокращение площади язвенной поверхности. К 15-м суткам в месте дефекта отмечался едва заметный точечный рубец, у некоторых животных язва заживала без рубца. Морфологически в опытной группе наблюдали усиление репаративных процессов. На 1-й день после начала лечения видна молодая грануляционная ткань с большим количеством новообразующихся капилляров и фибробластов. В ряде случаев дном язвы служит ткань печени, в которой также происходит накопление нейтральных и кислых мукополисахаридов. В некоторых местах происходит наползание уплощенного эпителия на язвенную поверхность. Отечность и частичные инфильтраты, встречаемые в контрольной группе, отсутствуют. К 10-му дню в краях и дне язвы отмечается интенсивный рост коллагеновых волокон. Ярко выражены процессы пролиферации и наползания эпителия, клетки которого содержат много нейтральных и кислых мукополисахаридов. К 15 - 21-му дню в месте нахождения язвы клетки имели нормальное строение, рубец отсутствовал. В эти же сроки в контрольной группе животных практически не наблюдалось сокращения площади язвенной поверхности. Наряду с образованием молодой грануляционной ткани по периферии язвы и в некоторых случаях дна язвы видны и явления прогрессирования язвы - эрозии слизистой, сливающиеся с язвенной поверхностью, склерозированные участки мышечного слоя, некротические массы. К 21-м суткам площадь язвенного дефекта сократились на 25 - 40%, однако все слои язвы отчетливо выражены. На поверхности большое количество некротических масс, инфильтрированных распадающимися лейкоцитами. На 30-й день язвенный дефект еще существует. Далее наблюдения не производились. Таким образом, результаты проведенных опытов позволяют заключить, что исследуемый состав при внутрижелудочном введении в разведении 1:100 (доза суммы простагландинов 0,04 мг/кг массы тела) эффективен при лечении язвы желудка. Он почти вдвое сокращает сроки заживления экспериментальной язвы желудка за счет стимуляции репаративных процессов в соединительной ткани и эпителии.
Формула изобретения
Способ получения препарата для лечения язвенной болезни желудка, предусматривающий глубинное культивирование гриба Fusarium sambicinum ВКМГ-3051 Д на жидкой питательной среде, включающей сахарозу, источник азота, калий фосфорнокислый однозамещенный и воду, с последующей экстракцией липидов органическими растворителями, отгонкой растворителя и растворением полученного остатка в подсолнечном масле, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, в среду дополнительно вводят мелассу, в качестве источника азота используют аммоний азотнокислый, при следующем соотношении компонентов, г/л: Меласса - 20 - 30 Сахароза - 20 - 25 Аммоний азотнокислый - 3 - 4 Калий фосфорнокислый однозамещенный - 2 - 5 Вода - До 1 л перед экстракцией липидов культуральную среду разделяют на биомассу и жидкую фазу и проводят раздельную экстракцию, при этом липиды из жидкой фазы экстрагируют хлороформом, а из биомассы последовательно и многократно этанолом и хлороформом, перед отгонкой растворителя полученные липидные экстракты объединяют и получают целевой продукт следующего состава, мас.%: Простагландин E2 и его эфиры - 0,039 - 0,073 Простагландин E206 и его эфиры - 0,031 - 0,057Фосфолипиды - 0,25 - 1,0
Подсолнечное масло - До 100
MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 07.04.2000
Номер и год публикации бюллетеня: 7-2002
Извещение опубликовано: 10.03.2002
