Штамм бактерий bacillus species - деструктор нефтепродуктов и фенолсодержащих соединений
Использование: очистка воды от нефтяных и фенольных загрязнений. Сущность: штамм бактерий Bacllfus species депонирован под номером ВКПМ В-5467. Штамм способен разрушать на 98-100% нефтепродукты и фенолсодержащие соединения в морской среде, 4 табл.
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ. (21) 4883668/13 (22) 10.10.90 (46) 30,12.92. Бюл. N 48 (71) Одесский государственный университет им. И.И,Мечникова (72) Н,Г.Астрова, Л,B,Ìîéñååâa и П,З.Протченко (56) Авторское свидетельство СССР
¹ 994567; кл. С 12 N 15/00, 1981.
Авторское свидетельство СССР
N. 1076446, кл. С 12 N 15/00. 1982.
Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается нового штамма бактерий, который может быть использован для очистки морской и пресной воды .от нефтяных и фенольных загрязнений, Известен штамм Strepiomyces alboaxiales "С", используемый для очистки сточных вод от нефти и нефтепродуктоц.
Штамм способен окислять нефть и вазелиновое масло на высокоминерализованных средах при повышенных температурах культивирования в пределах 60 сут.
Наиболее близким к заявляемому является Pseudomonas putida 36, используемый для очистки воды и почвы от нефти и нефтепродуктов. Штамм осуществляет деградацию нефти остаточной замазученности и может быть использован при очистке воды и почвы от загрязнений нефтепродуктами.
Недостатком указанного штамма .является невысокая скорость роста Pseudomonas putida 36 т.к, максимальная плотность 1,5 х 10 кл/мл штамма Pseudo11 -
monas putida 36 достигает только на 5-е — 6-е
„„Я2„„1784592 А1
SPECIES — ДЕСТРУКТОР НЕФТЕПРОДУКТОВ И ФЕНОЛСОДЕРЖАЩИХ СОЕДИНЕНИЙ (57) Использование: очистка воды от нефтяных и фенольных загрязнений, Сущность: штамм бактерий Bacillus species депонирован под номером ВКПМ В-5467. Штамм способен разрушать на 98 — 100% нефтепродукты и фенолсодержащие соединения в морской среде. 4 табл. сутки. Повышенная температура культивирования (30 С) усложняют применение штамма Pseudomonas putida 36 в полевых и производственных условиях для очистки воды и почвы, Длительность процесса деградации нефти Pseudomonas putida 36 — 30 сут. Количество нефти, утилизированной за это время, достигает 68,4-74,5% — это составляет невысокий уровень утилизации, Неспособность штамма Pseudomonas
putida 36 расти при 4 С и невозможность его использовать при очистке воды и почвы в холодных районах, Цель изобретения — получение нового штамма бактерий, обладающего высокой деструктивной активностью по отношению к комплексам углеводород- и фенолсодержащих соединений в сильно минерализованных средах, Поставленная цель достигается тем, что
Bacillus species 205 — 1/О обладает способностью использовать, в качестве источника питания и энергии, дизельное тепливо; гексан, бензол и фенол, окислять углеводороды
1784592 и фенолы при широком диапазоне их концентрации, Анализ предлагаемого технического решения на критерий "существенное отличие" показал, что штамм Bacillus species 205—
1/О является наиболее активным деструктором нефтепродуктов и фенолсодер>кащих соединений и может быть использован в нефтеперерабатывающей промышленности для .очистки сточных вод, содержащих нефтепродукты и фенол. Следовательно, техническое решение соответствует критерию "существенные отличия", Штамм Bacillus species 205-1/О выделен из морской воды Южно-Сахалинского побережья научно-исследовательской экспедицией в 1988 году и задепонировэн
ВКПМ соответственно под N. В-5467, Штамм выявлен экспресс-методом ин10
"СИ", позволяющей эффективно выделять штаммы бактерий-деструкторов различных загрязнителей из природной среды (пример
1), Новый штамм Bacillus species 205 — 1/О получен методом накопительной культуры, т.е. многократным пересевом на жидкую минеральную среду МА-1 (предложенную
Мойсеевой Л,В и Н,Г.Астротвой) с нефте25
30 продуктами — дизельное топливо, гексан, бензол и фенол.
Выращивание проводили в колбах на качалках (110 об/мин). Обьем среды 200 мл, концентрация нефтепродуктов и фенола
35 о
Полученный штамм бактерий Bacillus
species 205 — 1/О депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микроорганизмов (ВКПМ) под номером В-4567 и штамм Bacillus species BKRM В-5467 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.
Культурально-морфологические признаки. Клетки представляют собой гр+, Roдви>кные, перитрихиальное жгутование, спорообрэзующие палочки, размером 1,0—
1,5 х 0,6 — 0,8 мкм, образует термоустойчи40
45 вые эндоспоры — размер 0,8 х 0,5 мкм. МПА (28 С, 48 ч) образуют плотные белые колонии, потом становятся бурые, пигмент проникает в субстрат, окрашивает его в соответствующий цвет. Образование пигмента происходит от края к средней части, колонии гладкая. блестящая. Mll6 (28 С, 48 ч — образует пленку и муть. Агаризованная среда Кинга — образует пигмент коричневобурого цвета. Синтетическая среда нэ мор50
55 ской воде (28 С, 48 ч) образует мелкие серовато-белые колонии диаметром 1.5 — 2,3 дикации на стандарт-индикаторной среде:20 мм, Колонии на твердых агэризованных средах не ослизняются в течение 30 дней.
Физиолого-биохимические признаки.
Факультативный анаэроб, Температурный диапазон роста в пределах +4 + 43,5 С, оптимум температуры — 27 С, Оптимум рН—
7,0-7,2. Рост при 7% NaCI. Желатину разжижает; крахмал гидролизует; нитраты восстанавливает до нитритов; индол, сероводород, аммиак не образует. Каталазоположительные. Липолитическая активность — отрицательная, Лецитиназная— вариабильна. Реакция Фогес-Проскауэра— положительная. Отношение к источникам углерода. Хорошо усваивает и растет с образованием кислоты на глюкозе, арабинозе, манните, ксилозе.
Штамм хранится на агаризованной среде МА-1 следующего состава (г/л):
Вода водопроводная 1л
МПА 30 г
ККОз 1г йаНРО4 1г
NaCI 1,5 r
d,l, а — P-аланин 1 y/мл
Дестибиотин 1 y/ìë рН 7,0-7,2
В качестве источника углерода вносится
1 / нефтепродуктов или фенола. Хранят под слоем стерильного вазелинового масла, пересев 2 раза в 4 года.
В табл.1 представлены данные по влиянию различных антибиотиков на штамм
Bacillus зрес1ез ВКПМ В-54 67.
Штамм Вас!Низ species BКПМ В-5467 идентифицирован по определителю Верги (1974) какк разновидность группы Bacillus.
Пример 1. Экспресс-метод индикации бактерий-деструкторов углеводород" и фенолсодержащих соединений.
Приготовление .стандартно-индикаторной среды осуществляют путем смешивания агар-агара с синтетической средой (MA-1) и добавлением дибромтимосульфофталеином (1 мг в 1 мл 96 спирта и 1 капля глицерина)
+ продукт метаболизма тест-культуры а
Bacillus species 13 . Тест-культура получена на жидкой синтетической среде МА-1 на 16 сутки культивирования при температуре 2527 С. Подвержена тепловой обработке методом 3-х разовой пастеризации с последующей фильтрацией. Добавляется Раланин, необходимый для роста в среде бактерий-деструкторов нефти, нефтепродуктов и фенола.
Состав индикаторной среды (r/ë);
Водопроводная вода 1л
Агар-агар 20r
Индикатор 1 мл
1784592
Продукты метаболизма 15 мл
КЙОз 1 Г
NazHP04 1г
Р-Аланин 1 y/ìë рН 7,0 — 7,2
Стерильную индикаторную среду разливают в пластмассовые бакпечатки в количестве 10 мл. На остывшую поверхность среды накладывают бумажные диски, пропитанные нефтью, нефтепродуктами или высокотоксичными соединениями типа фенола. Среда может храниться в течение 3 месяцев при температуре+3+15 С, На подготовленную т.о. поверхность наносят пробы морской или пресной воды в количестве
0,1 мл, оставляют при температуре 18-25 С в течение 12-24 ч. По изменению цвета среды первоначального желто-соломенного цвета в интенсивный темно-зеленый — судят о наличии бактерий-деструкторов, способных расти в присутствии углеродсодержащих и фенольных соединений, Полученные штаммы бактерий-деструкторов очищают путем многократных пересевов на твердой синтетической среде МА-1, Штамм проверятся на деструктивную активность и способность разлагать дизельное топливо, гексан, бутанол, фенол.
Пример 2. Микробная деструкция дизельного топлива осуществляется штаммом Bacillus species ВКПМ В-5467 на морской среде следующего состава:
Морская соль 2%
NH4Cl (эммоний хлористый) I г/л
Калий фосфорнокислый двузэмещенный К2НР04 или NazHPO4 1 г/л
Дестибиотин 0,001% или
Дрожжевой экстракт 1 мл/л . Вода водопроводная 1 л рН 7,2-7,5
В качестве субстрата для деструкции вводили: дизельное топливо в количестве
500 мг/л, 250 мг/л, 150 мг/л, 100 мг/л, 50 мг/л, 1050 мг/л. рН среды регулировали 10/ раствором
NaOH. Деструкцию проводили штаммом
Baciilus species ВКПМ В-5467 на,носителе перлит фильтровэльный (ТУ-21-3144-82) в количестве 10 г/л.
В колбы обьемом 1 л вводили морскую среду — 500 мл, бактерии носитель вводили одновременно. Колбы помещали в первые 6 часов на качалки 100-120 об/мин.
5 Последующее культивирование осуществляли в стационарных условиях при l8"C.
Результаты деструкции учитывались через
24, 48, 72 и 120 ч, методом количественного определения. Результаты пр"дставлены в
10 табл,2, Таким образом. скорость микробной де.струкции дизельного топлива штаммом
BaciiIus species 50 мг в сутки. Результаты микробного разложения бензола приведе15 ны в примере 3, Пример 3. При микробной деструкции бензола готовили раствор морской воды вышеприведенного состава (пример 2).
Бензол в качестве субстрата вводили в
20 количестве 500 мг, 250 мг, 150 мг, 100 мг, 50 мг и 1050 мг/л. Результаты деструкции учитывали через 24, 48, 72 и 120 ч. Результаты представлены. в табл.3. . Таким образом, скорость микробной де25 струкции бензола составляла 100 мг в сутки.
Пример 4, Микробную деструкцию в комплексе гексан + фенол осуществляли способом, описанным в примере 1, Гексан+ фенол в качестве субстрата для деструкции, 30 вводили в соотношении 1:1 в количестве 250 мг/л, 150 мг/л 50 мг/л и 25 мг/л.
Результаты деструкции учитывали через 3, 5, 8, 10 и 16 суток. методом количественного определения субстрата. Резуль35 таты представлены в табл,4.
Таким образом, скорость микробной деструкции гексана + фенола составляла 100 мг за 8 сут.
Сопоставив приведенные примеры
40 можно сделать вывод, что использование предлагаемого штамма Bacillus species
ВКПМ В-5467 позволяет осуществлять деструкцию дизельного Tollëèaà со скоростью
50 мг в сутки, бензола — 100 мг в сутки, 45 гексан+ фенол — 100 мг за 8 сут на 98-100; в морской воде.
Применение предлагаемого штамма
Bacillus species BKilM В-5467 увеличит эффективность очистки от нефтепродуктов и
50 фенола в условиях реального производства.
Формула изобретения
Штамм бактерии Bacillus species ВКПМ
B-5467 — деструктор нефтепродуктов и фенолсодержэщих соединений.
1784592
Таблица 1
Таблица 3
Таблица 4
Редактор Т.Горячева
Заказ 4346 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101
Субстра ветру
Бенз
Бенз
Бенз
Бенз
Бенз
Бе,нз
Таблица.2
Микробная деструкция штаммом Bacillus species
ВКПМ В-5467 дизельного топлива в морской воде
/периодических условиях/
Микробная деструкция бензола в морской воде штаммом Bacillus species ВКПМ B-5467 /периодическое культивирование/
Микробная деструкция гексана и фенола штаммом
ВасШцз species ВКПМ В-5467 в морской воде
/при периодическом культивировании/
Составитель Н.Асторова
Техред M.ÌîðãeHTàë Корректор Е.Папп
