Способ получения препарата целлюлолитической ассоциации бактерий рубца
Использование: микробиологическая промышленность, получение препаратов на основе бактериальных продуцентов целлюлаз. Сущность изобретения готовят посевной материал путем культивирования целюлолитической бактериальной ассоциации на среде, содержащей свекловичный жом 0,4-0,8 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,07-0,11 г , дрожжевой автолизат 0,02-0,06 г, сернокислый магний 0,06-0,014, калий хлористый 0, 002-0,006 г сернокислый аммоний 0,07-0,11 г, уксуснокислый натрий 0,05-0,65 мг, натрий изомаслянокислый 0,6-10,0 мг, натрий изовалериановокислый 7,5-11,5 мг, натрий валериановокислый 7,5-11,5 мг, вода до 100 мл в течение 2-4 сут при 37-39°С. Получают посевной материал с титром 1-2 109 кл/мл. Полученный посевной материал пересевают на п ро из во дсТве иную среду, содержащую свекловичный жом 2,0-4,02, дрожжевой автолизат 0,01-0,3 г, аммоний сернокислый 0,25-0,45 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,4-0,6 г, магний сернокислый - 0,006-0,014 г, калий хлористый 0,03-0,07 г, натрий сернистый 0,01- 0,03 г, кальций углекислый 0,1-0,3 г, фильтрат культуральный жидкости 20,0- 30,0 мл, вода до 100 мл, и культивируют в анаэробных условиях при температуре 37- 39°С в течение 2-3 сут. Получают культуральную жидкость с титром 10 -1011 кл/мл, которую затем в ысушиваТот/с ухбй препарат содержит не менее 400 106кл/г, целлюлолитическая активность (по методу Хендерсона) - не менее 8%, КМЦ - осахаривающая активность - 35 ± 2 ед/г. 4 табл. сл С со -- кэ Ю -ч
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР)
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ "-",,,:":. -:.: :, -;;,-, К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА
ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКОЙ АССОЦИАЦИИ
БАКТЕРИЙ РУБЦА (57) Использование: микробиологическая промышленность, полученйе препаратов на основе бактериальных продуцентов целлюлаэ Сущность изобретения: готовят посевной материал путем культивирования целюлолитической бактериальной ассоциации на среде, содержащей свекловичный жом 0;4 — 0,8 r, натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,07 — 0,11 г., дрожжевой автолиэат 0,02-0,06 г, сернокислый магний ации рубца жвачных животных, включающий культивирование ассоциатов бактерий коровы и-лося Аа ййтательйой среде, содер жащей в качестве источника целлюлозы мелкоизмельченную фильтровальную бумагу, в качестве источников минерального и органического азота — сульфат аммония и пептон, в качестве источйиков фосфорного
1 (21) 4841105/13 (22) 10.05.90 (46) 15.12.92. Бюл. М 46 (71) Московский технологический институт пищевой промышленности и Всесоюзный научно-исследовательский институт биохимии, физиологии и питания сельскохозяйственных животных (72) И. М. Грачева, В. М. Кантере, Н. Н. Гаврилова, M. В. Рождественская, Н. Ю. Князева, И. А, Быстрова, Б. В, Тараканов и Т. А.
Николичева (56) Отчет ВНИИФБиП сельскохозяйственных животных, 1985, 1987 N. 011840073990.
Изобретение относится к микробиоло-. гический промышленности, а именно к-Способам получения препаратов на основе бактериальных продуцентов целлюлоз, включающих анаэробное культивирование и сушку препарата.
Известен способ получения препарата целлюлолитической бактериальной ассоци„„. Ж„„1781297 А1 (sr)s С 12 P 39/00, А 23 К 1/00, С 12 N 1/20
0,06-0,014, калий хлористый 0; 002 — 0,006 r, сернокислый аммоний 0,07 — 0,11 r, уксуснокислый натрий 0,05-0,65 мг, натрий изомаслянокислый 0,6 — 10,0 мr, натрий изовалериановокислый 7,5 — 11,5 мг, натрий валериановокислый 7,5 — 11;5 мг, вода до 100 мл в течение 2 — 4 сут при 37 — 39 С. Получают посевной материал-с титром 1 — 2 10
9 кл/мл. Полученный посевной материал пересевают на производстве нную"среду, содержащую свекловичный жом 2,0-4,02, дрожжевой автолизат 0,01 — 0,3 г, аммоний сернокислый 0,25 — 0,45 r, натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,4-0,6 г, магний сернокислый = 0,006 — 0,014 г, калий хлористый 0,03-0,07 г, натрий сернистый 0,010,03 г, кальций углекислый 0,1 — 0,3 r, фильтрат культуральный жидкости 20,030;0 мл, вода до 100 мл, и культивируют в аназробных условиях при температуре 37—
390С в течение 2 — 3 сут. Получают культуральную жидкость с тит Жм 10 -10 кл/мл, которую затем"высушивают,"сухой препарат содержит не менее 400 10 кл/г, целлюлолитическая активность (по методу Хендерсона) — не менее 8;ь, КМЦ вЂ” осахаривающая активность — 35 +. 2 ед/г. 4 табл.
1781297 питания — одно- и двуэамещенный фосфаты калия, в качестве источников летучих жирных кислот (ЛЖК) — отфильтрованную рубцовую жидкость, Недостатком этого способа является использование в составе среды дорогих и дефицитных компонентов: пептона, рубцовой жидкости, фосфатов калия, которые эффективны при лабораторных исследованиях, но
10 не могут быть использованы при промышленном производстве.
Наиболее близким к предлагаемому способу по технической сущности и достигаемому результату является способ получе-ния препарата целлюлолитической 15 ассоциации рубца, включающий получение посевного материала на питательной среде, содержащей в качестве источника целлюлозы полоски фильтровальной бума20 ги, в качестве источника минерального и
45 ассоциации бактерий вместе с остатками питательной среды и сушку.
Недостатками данного способа являются высокая стоимость и дефицитность используемых компонентов питательной среды..
Цел ь ю изобретения я вля ется удешевле- 50 ние препарата активной целлюлолитической ассоциации рубца путем замены дорогих и дефицитных компонентов пйтательной среды более дешевыми и технологичнйми, а также создание малоотходной 55 технологии за счет использования отходов собственного производства.
Поставленная цель достигается тем, что в способе получения препарата активной целлюлолитической ассоциации бактерий органического азота — сульфат аммония, пептон, дрожжевой экстракт, в качестве источников фосфорного питания — одно- и двуэамещенные фосфаты калия, в качестве редуктона — цистеин солянокислый, в каче- 25 стве источника fDKK — отфильтрованную рубцовую жидкость, культивирование целлюлолитической ассоциации на питательной среде следующего состава: травяная мука — 1,0г, дрожжевой экстракт — 0,1г, 30 пептон — 0,1г, калий фосфорнокислый однозамещенный — 0,02г, калий фосфорно кислый двузамещенный — 0,05 r, магний сернокислый — 0,01 г, кальций хлористый — 0,001r, натрий хлористый — 0,1 г, аммо- 35 ний сернокислый — 0,05г, цистеин солянокислый — 0,02г, натрий углекислый — 0,4 г, натрий уксуснокислый — 0,36 мг, натрий изомаслянокислый — 8,2 мг, натрий изовалериановокислый — 9,7 мг, натрий вале- 40 риановокислый — 9;7 мг, вода — до 100 мл, рН среды — 7,0 — 7,2; культивирование в анаэробных условиях; в течение 4-5 суток; отделение клеток целлюлолитической
007 — 0,11 г
001 — 0,03 r
7,5 — 11,5 мг рубца, предусматривающем приготовление посевного материала на среде, содержащей источник целлюлозы, минеральные и органические источники азотного и фосфорного питания, сульфат магния, редуктон, ЛЖК или их натриевые соли и воду, культивирование целлюлолитической бактериальной ассоциации на питательной среде, содержащей источники целлюлозы, источники минерального и органического азота, источники фосфорного питания, редуктон, источники
ЛЖК, и воду, до максимального накопления титра; отделение клеток бактериальной ассоциации от культуральной жидкости и сушку осадка; отличием является то, что питательная среда для приготовления посевного материала содержит в качестве источника целлюлозы свекловичный жом, в качестве источника органического азота— автолизат дрожжей, в качестве редуктона— натрий сернистый, источника фосфорного питания — натрий фосфорнокислый двузамещенный, в качестве источников ЛЖК— ацетат, изобутират, иэовалериат и валериат натрия, при следующем соотношении компонентов; свекловичный жом 0,4 — 0,8 r дрожжевой автолизат 0,02 — 0,06 r натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,07-0,11 r магний сернокислый 0,006 — 0,014 r калий хлористый 0,002 — 0,006 r аммоний сернокислый натрий сернистый натрий уксуснокислый . 0,05 — 0,65 мг натрий изомаслянокислый 6,0 — 10,0 мг натрий иэовалериановокислый натрий валериановокислый 7,5 — 11,5 мг вода до 100 мл культивирование целлюлолитической ассоциации бактерий рубца ведут на питательной среде, содержащей в качестве источника целлюлозы — жом свекловичный, в качестве источника органического азота — автолизат дрожжей, при соотношении целлюлозы и органического азота от
10:1 до 23:1, в качестве редуктона — натрий сернистый, в качестве источника фосфорного питания — натрий фосфорнокислый двуэамещенный, в качестве источника ЛЖК— фильтрат культуральной жидкости целлюлолитической ассоциации бактерий рубца, при следующем соотношении компонентов:
1781297
5 6 свекловичный жом 2,0-4,0 г . более дешевой и доступной солью — натридрожжевой автолизат 0,1-0,3 r ем фосфорнокислым двузамещенным, натрий фосфо нокислый р ф сфорнокислый, Кальций хлористый, натрий хлористый и двузамещенный 0,4-0,6 г натрий углекислый заменили двумя солями магний сернокислый 0,006 — 0,014 г 5 калием хлористым и кальцием углекислым. калий хлористый 0,03-0,07 г Используемый в качестве редуктона для аммоний сернокислый 0,25-0,45 г поддержания анаэробных условий дефицитнатрий сернистый 0,01-0,03 г ный цистеин солянокислый заменили натрикальций углекислый 0,1-0,3 г . ем сернистым (табл. 1). фильтрат культуральной . 10 Для создания условий, аналогичных усжидкости 20-30мл "": ловиям рубца жвачных животных, в питавода .. до 100 мл тельные среды вводят источники ЛЖК. с последующим отделением биомассы Источниками ЛЖК в питательной среде для бактериальных клеток с непотреблен- приготовления посевного материала служат ными остатками питательной среды и вы- 15 натриевые соли ЛЖК: натрий уксуснокислый сушиванием остатка. -0,05-0,65 мг, натрий изомаслянокислый—
Использование в качестве источника 6,0-10,0 мг, натрий изовалериановокисцеллюлозы для приготовления посевного лый — 7,5-11,5 мг j(„ aтрий валериановоматериала и культивирования целлюлоли- "кислый — 7,5 — 11;5 мг . тической бактериальной ассоциации рубца 20 При конструировании питательной сресвекловичного жома вместо фильтроваль- ды для культивирования ассоциации исхоной бумаги и травяной муки обеспечивает дили из тех же принципов использования хороший рост и высокий титр и целлюлоз- дешевых и доступных компонентов. В каче.тическую активность. Свекловичный жом — стве источника углерода в питательной среотход сахарного производства, широко ис- 25 де, взамен травяной муки, используют пользуется как для кормовых целей; так и в свекловичный жом в концентрации 2,0-4,0 микробиологической промышленности фи ; Травяная мука производится в хозяйстприготовлениипитательныхсреддля выра- вах для собственных кормовых потребнощиваниямикроскопических грибов-проду- стей, и стоимость ее значительна, поэтому центов целлюлаз. В этом случаедля лучшего 30 она не может быть использована при происпользования и усвоения микроскопиче- мышленном производстве"препарата. Исскимигрибамисвеклоцичногожоманеобхо- . точником органического азота в дим предарительный полный или частичный питательной среде для культивирования гидролиз его полисахаридов. Продуценты ассоциации служит дрожжевой автолизат, бактериальных целлюлаз обладают боль- 35 Используемые в прототипе в качестве оргашим сродством кнативной кристаллической . нических источников азота дрожжевой эксцеллюлозе, по сравнению с грибнйми цел- . тракт и пептон имеют очень высокую люлазами, Капиллярно-пористая коллоид- . стоимость. Дрожжевой автолизат значиная структура свекловичного жома, в..тельнодешевлеисодержитвсвоем составе которой вода химически и физически свяэа- 40 значительное количество" легкоусвояемого на, обеспечивает лучшую адсорбцию бакте- . органического азота (не менее,, ): сырого риальных клеток на лигнино-целлюлозном протеина — 50,0, растворимого белка — 10,0, субстрате, Содержащийся в свекловичном аминного азота — 1,5. Внесение в питательжоме органический азот, микроэлементы и ную среду для культивированйя дрожжеворостовые вещества, при подобранной кон- 45 го автолизата в концентрации 0,1-0,3 % центрации его в посевной питательной сре- позволяет обеспечить бактериальные клетде, полностью обеспечивают ассоциацию ки целлюлолитической ассициации растворимым белком и аминным азотом.
При конструировании солевого состава Оптимальное соотношение свекловичного питательной среды для приготовления " tio- 50 жома идрожжевого автолизата — 10:1-23:1. севного материала исходили из принципа При конструирОвании солевого состава обеспеченности ассоциации необходимы- питательной среды для культивирования асми элементами, но вводимыми в вйде до-- Социацйи исходйли из тЫо же принципа, ступных и недорогих солей. Источники . что идля посевной питательнойсреды. фосфорного питания по способу-прототипу 55 Определение оптимальных концентра— калий фосфорнокислый однозамещенный ций компонентов питательных сред для выи калий фосфорнокислый двузамещейный ращивания посевного материала и дорогие и дефицитные, используемые-ля фермантации целлюлолитической ассоциамедицинской промышленности, заменили ции рубца проводили постановкой экспери1781297 ментов по методу математического планирования.
Оптимизация концентраций источников углерода и азота в питательных средах и их соотношения проводилась постановкой 5 экспериментов по ортогональному плану для трех факторов (свекловичный жом, дрожжевой автолизат, аммоний сернокислый) на пяти уровнях (соответственно, для посевной питательной среды: от 0,4 до 10
0,8%, от 0,02 до 0,06%, от 0,07 до 0,11%; для ферментационной среды: от 2,0 до 4,0%, от
0,1 до 0,3%, от 0,25 до 0,45%), Оптимизацию концентраций минеральных компонентов питательных сред проводили постановкой 15 экспериментов по ортогональному плану для пяти факторов(натрий фосфорнокислый двузамещенный, магний сернокислый, калий хлористый, натрий сернистый, кальций углекислый) на пяти уровнях (соответствен- 20 но, для посевной питательной среды: от 0,07 до 0,11%, от 0,006 до 0,014%, от 0,002 до
0,006%, от 0,01 до 0,03%, от 0 до 0,08%; для ферментационной питательной среды: от
0,4 до 0,6%, от 0,006 до 0,014%, от 0,03 до 25
0,07%, от 0,01 до 0,03%, от 0,1 до 0,3%).
Результаты экспериментов, подтверждающие установленные оптимальные концентрации каждого компонента питательной среды и их граничйые значения, 30 представлены в табл. 3 — для посевной питательной среды и в табл. 2 — для ферментационной питательной среды.
Источником ЛЖК в питательной среде для выращивания посевного материала являются натриевые соли уксусной, изомасляной, изовалериановой и валериановой кислот.
Источником ЛЖК в питательной среде для культивирования ассоциации служит фильтрат культуральной жидкости, получаемый после отделения биомассы, Содержание ЛЖК в фильтрате культуральной жидкости через 48 ч находится на уровне
154,5 мг% (табл. 4). При внесении 20-30% об. фильтрата концентрация ЛЖК в питательной среде достигает оптимального уровня — 39,0 — 46,0 мг%.
Способ осуществляется следующим образом:
Посевной материал для анаэробного культивирования целлюлолитических бактериальных ассоциаций рубца готовят на питательной среде следующего состава: свекловичный жом 0,4 — 0,8 r натрий фосфорнокислый двузамещенный 0,07 — 0,11 г дрожжевой автолизат 0,02-0,06 r магний сернокислый 0,006-0,014 r калий хлористый 0,002 — 0,006 r
0,07 — 0,11 r
0,01 — 0,03 г
0 05 — 0.65 мг, аммоний сернокислый натрий сернистый натрий уксуснокислый натрий изомаслянокислый 6,0-10,0 мг натрий изовалериановокислый 7,5 — 11,5 мг натрий валерианово- . кислый 7,5 — 11,5 мг вода до 100 мл. рН питательной среды 6,8-7,2. Питательные среды готовят в пробирках объемом 50 мл, коэффициент заполнения 0,8. В пробирки вносят навески свекловичного жома, дрожжевого автолизата, 20%-ные растворы натрия фосфорйокислого двузамещенного, магния сернокислого, калия хлористого, аммония сернокислого, натрия сернистого в расчете на 40 мл питательной среды, объем доводят до 20 мл водой и стерилизуют в автоклаве при 0,1 МПа 40 минут. Раствор солей ЛЖК стерилизуют при 0,05 МПа 30 минут. Пробирки со средой засевают посевным материалом в количестве 5% об., вносят раствор солей ЛЖК и доводят объем стерильной водой до 40 мл, закрывают гидравлическими затворами. Выращивание осуществляют в анаэробных условиях при температуре 38 + 1 С в течение 2 — 4 суток.
Получают качественный посевной материал с титром 1 — 2 10 кл/мл.
Культивирование целлюлолитических ассоциаций бактерий рубца проводят на среде следующего состава: свекловичный жом 2,0 — 4,0 r дрожжевой автолизат 0,1 — 0,3 r аммоний сернокислый 0,25-0,45 г натрий фосфорнокислый двузаме@енный . 0,4 — 0,6 г магний сернокислый 0,006-0,014 r калий хлористый 0,03 — 0,07 г натрий сернистый 0,01-0,03 г кальций углекислый 0,1-0,3 г фильтрат культуральной жидкости 20,0-30 мл вода до 100 мл
Среду готовят в колбах обьемом 500 мл, коэффициент заполнения питательной средой — 0,8. В колбы вносят навески свекловичного жома, дрожжевого автолизата., мела, 20%-ные растворы натрия фосфорнокислого двузамещенного, магния сернокислого, аммония сернокислого, калия хлористого, натрия сернистого в расчете на
400 мл питательной среды, доводят обьем водой до 200 мл, стерилизуют в автоклаве при 0,1 МПа в течение 40 мин. Отдельно стерилизуют фильтрат культуральной жидкости при 0,05 МПа 30 минут, Засев производят посевным материалом в количестве
1781297
10 затворами и выдерживают в анаэробныхус- 5 ловиях при температуре 38 + 1 С втечение
2 — 3 суток. По окончании культивирования
КМ Ц-осахаривающая активность кул ьтуральной жидкости Составляет 2 — 4 ед/мл, 10
30
50
5-10 % об, В колбы вносят стерильный фильтрат культуральной жидкости (80-120 мл) и доводят объем стерильной водой до
400 мл. Колбы закрывают гидравлическими целлюлолитическая активность по методу
Хендерсона в модификации Чюрлиса 10-15
, титр продуцента — 10 — 10 кл/мл. Бака териальную массу с непатребленными остатками питательной среды отделяют и высушивают известными способами. Полученный сухой препарат имеет следующие характеристики: содержание жизнеспособных бактериальных клеток не менее 400х х10 кл/г, целлюлолитическая активность по методу Хендерсона не менее 8%, КМЦ— осахаривающая активность — 35 +. 2 ед/г.
Пример 1, Посевной материал целлюлолитической ассоциации бактерий рубца, состоящей из культур Ruminococcus
a lb us, Clostridlum lochheadii, CI, Chermocelluloiyticus (ассоциация М 1), готовят на питательной среде следующего состава: свекловичный жом — 0,5 г, дрожжевой автолизат — 0,03 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный — 0,08 г, магний сернокислый — 0,008 г, калий хлористый — 0,003 г, аммоний сернокислый.— 0,08 r, натрий сернистый — 0,015 г, соли ЛЖК: натрий уксуснокислый — 0,2 мг, натрий изомаслянокислый — 7,0мг, натрий изовалериановокислый — 8,5 мг, натрий валериановокислый — 8,5 мг, вода — до 100 мл. Предварительно готовят 20%ные растворы солей: натрия фосфорнокислого двузамещенного, натрия сернистого, магния сернокислого, калия хлористого, аммония сернокислого: а также раствор солей ЛЖК: натрий уксуснокислый — 0,02 г, натрий изомаслянокислый — 0,7 r, натрий изовалериановокислый — 0,85 г, натрий валериановокислый — 0,85 г, натрий валериановокислый — 0,85 r в 100 мл воды. Среду готовят в пробирках вместимостью 50 мл, коэффициент заполнения питательной средой — 0,8. В пробирки вносят навески свекловичного жома (0,2 r), дрожжевого автолизата (0,012 г), 20%-ные растворы солей: натрия фосфорнокислого двузамещенного — 0,16 мл, магния сернокислого — 0,016 мл, калия хлористого — 0,006 мл, аммония сернокислого — 0,16 мл, натрия сернистого — 0,03 мл в расчете на 40 мл питательной среды, объем доводят до 20 мл водой и стерилизуют в автоклаве при 0,1 МПа 40 мин, Раствор солей ЛЖК стерилизуют в автоклаве при 0,05 МПа 30 мин, Засев питательной среды производят в стерильных условиях жидкой культурой ассоциации бактерий в количестве 5 % об. (2,5 мл). После засева в пробирки стерильно вносят раствор солей
ЛЖК (0,4 мл) и стерильную воду до объема
40 мл. Пробирки закрывают гидравлическими затворами и помещают в термастат с температурой 38 + 1 С, Длительность выращивания посевного материала — 2 суток.
Готовый посевной материал имеет титр (1 + 0.5) 10 кл/мл и целлюлолитическую активность по КМЦ (КМЦ-ocax,) — (0,3 + 0,05) ед/мл, 5 Для выращивания целлюлолитической бактериальной ассоциации рубца готовят питательную среду следующего состава: свекловичный жом — 2,5 г, дрожжевой автолизат — 0,15 r, натрий фосфорнокислый двузамещенный — 0,45 r, магний сернокислый—
0,008 г, калий хлористый — 0,04 г, аммоний сернокислый — 0,3 г, натрий сернистый—
0,015 г, кальций углекислый — 0,15 r; фильтрат культуральной жидкости — 20,0 мл, вода — до 100 мл. Предварительно готовят 20%ные растворы минеральных солей. Среду сотовят в колбах объемом 500 мл. В колбы вносят навески свековичного жома (10 г), дрожжевого автолизата (0,6 г), мела (0,6 г), 20 -ные растворы солей: натрия фосфорнокислого двузамещенного — 9 мл, магния сер. нокислого — 0,16 мл, калия хлористого — 0,8 мл, аммония сернокислого — 6 мл, натрия сернистого — 0,3 мл, воду до 200 мл, закрывают резиновыми пробками, пробки закрепляют, и колбы стерилизуют при 0,1 МПа 40 минут. Фильтрат культуральной жидкости, полученный после культивирования бактериальной целлюлолитической ассоциации и отделения центрифугированием клеток вместе с остатками питательной среды, стерилизуют при 0,05 МПа 30 мин и вносят стерильно в готовую питательную среду в количестве 80 мл. Затем вносят стерильно
5 посевной материал (40 мл) из пробирок и стерильную воду до общего объема 400 мл.
Колбы закрывают резиновыми пробками с гидравлическими затворами, Культивирование проводят в термостате при температуре
38 1 С, длительность культивирования 3 суток, По окончании культивирования титр клеток составляет (2 - 0,5) 10" кл/мл, целлюлолитическая активность по методу
Хендерсона — 10 и 0,5, КМЦ-осах. активность — 2,0 + 0,2 ед/мл.
Пример 2. Посевной материал целлюлолитической бактериальной ассоциации hb
1 готовят на питательной среде следующего состава: свекловичный жом — 0,7 г, дрожже1781297
12 вой автолизат — 0,05 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный — 0,1 г, магний сернокислый — 0,012 г, калий хлористый — 0,005 г, аммоний сернокислый — 0,1 г, натрйй серни.стый — 0,025 г, соли ЛЖК: натрий уксусно- 5 кислый — 0,5 мг, натрий изомаслянокислый — 9,0 мг, натрий изовалериановокислый—
10,5 мг, натрий валериановокислый — 10,5 мг, вода — до 100 мл.
Процедуры приготовления питательной 10 среды, стерилизаций, засева и условия культивирования аналогичны описанным в примере 1. Готовый посевной материал имеет титр(1 +- 0,5) 10 кл/мл и КМЦ-осах, активность — 0,3 +0,,05 ед/мл. 15
Для выращивания целлюлолитической бактериальной ассоциации рубца готовят питательную среду следующего состава: свекловичный жом -3,5 r, дрожжевой автолизат — 0,25 r, аммоний сернокислый — 0,4 г, 20 калий хлористый — 0,06 r, натрий фосфорнокислый двузамещенный — 0,55 г, кальций углекислый — 0,25 г, натрий сернистый—
0,025 г, магний сернокислый -0,012 r, фильтрат культуральной жидкости — 15,0 мл, вода 25 — до 100 мл, Процедуры приготовления питательной среды, стерилизации, засева и условия культивирования аналогичны описанным в примере 1; 30
По окончании культивирования титр клеток составляет (2 + 0,5) 10 кл/мл, КМЦ-осах. активность — 2,0 и 0,2 ед/мл.
Пример 3. Посевной материал целлюлолитической бактериальной ассоциации М 35
1 готовят на питательной среде следующего состава: свекловичный жом — 0,6 г, дрожжевой автолизат — 0,04 г, аммоний сернокислый — 0,09 r, калий хлористый — 0,004 r, натрий фосфорнокислый двузамещенный — .40
0.09 г, натрий сернистый — 0,02 г, магний сернокислый — 0,01 г, соли ЛЖК: натрий уксуснокислый — 0,35 мг, натрий изомаслянокислый — 8,0 мг, натрий изовалериановокислый — 9,5 мг, натрий валериановокислый 45 — 9,5, вода — до 100 мл.
Процедуры приготовления питательной среды, стерилизации, засева и условия культивирования аналогичны описанным в примере 1, 50
Готовый посевной материал имеет титр (1 + 0,5) 10 кл/мл и КМЦ-осах. активность — 0,3 + 0,05ед/мл.
Для выращивания целлюлолитической бактериальной ассоциации рубца готовят 55 питательную среду следующего состава: свекловичный жом — 3,0 г, дрожжевой автолизат — 0,2 г„аммоний сернокислый — 0,35 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный—
0,5 г, калий хлористый — 0,05 г, кальций углекислый — 0,2 г, натрий сернистый — 0 02 г, магний сернокислый — 0,01 г, фильтрат культуральной жидкости — до 100 мл.
Процедуры приготовления питательной среды, стерилизации, засева, а также условия культивирования аналогичны описанным в примере 1.
По окончании культивирования титр клетоксоставляет(2 +.0,5) 10" кл/мл, целлюлолитическая активность по методу Хендерсона-15 +0,5 7, КМЦ-осах, активность
-4,0 + 0,2 ед/мл.
Пример 4, Посевной материал целлюлолитической бактериальной ассиации hL 1 готовят на питательной среде следующего состава: свекловичный жом — 0,4 г, дрожжевой автолизат — 0,02 г, аммоний сернокислый — 0,07 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный — 0,07 г, магний сернокислый — 0,006 г, калий хлористый — 0,002 r, натрий сернистый — 0,01 г, соли ЛЖК: натрий уксуснокислый — 0,05 мг, натрий изомаслянокислый — 6,0 мг, натрий изовалериановокислый — 7,5 мг, натрий валериановокислый — 7,5 мг, вода — до 100 мл.
Процедуры приготовления питательной среды, стерилизации, засева и условия культивирования аналогичны описанным в примере 1, Готовый посевной материал имеет титр (1 + 0,5) 10 кл/мл и КМЦ-осах. активность
8 —.0,1 -0,02 ед/мл.
Для выращивания целлюлолитической бактериальной ассоциации рубца готовят питательную среду следующего состава; свекловичный жом — 2,0 r, дрожжевой автолизат — 0,1 г, аммоний сернокислый — 0,25 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный—
0,40 г, калий хлористый — 0,03 г, кальций углекислый — 0,10 r, натрий сернистый — 0,01
r, магний сернокислый — 0,006 г, фильтрат культуральной жидкости — 20,0 мл, вода — до
100 мл.
Процедуры приготовления питательной среды, стерилизации, засева, культивирования аналогичны описанным в примере 1.
По окончании культивирования титр клеток составляет (1 и 0,5) 10 кл/мл, целлюлолитическая активность по методу
Хендерсона — 5-7, КМЦ-осах. активность — 1,5-0,1 ед/мл.
Пример 5, Посевной материал целлюлолитической бактериальной ассоциации М
1 готовят на питательной среде следующего состава; свекловичный жом — 0,80 r, дрожжевой автолизат — 0,06 г, аммоний сернокислый — 0,11 r, натрий фосфорнокислый двузамещенный — 0,11 г, магний сернокислый — 0,014 r, калий хлористый — 0,006 г, 13
1781297
14 натрий сернистый — 0,03 г, соли ЛЖК: натрий уксуснокислый — 0,65 мг, натрий изомаслянокислый — 10,0 мг, натрий изовалериановокислый — 11,5 мг, натрий валериановокислый — 11,5 мг, вода — до 100 мл.
Процедуры приготовления питательной среды, стерилизации, засева и условия культивирования аналогичны описанным в примере 1.
Готовый посевной материал имеет титр (1-2) 10 кл/мл, КМЦ-осах, активность — 0,1 + 0,02 ед/мл.
Для выращивания целлюлолитической бактериальной ассоциации рубца готовят питательную среду следующего состава: свекловичный жом — 4,0 r, дрожжевой автолиэат — 0,30 r, аммоний сернокислый — 0,45
r, натрий фосфорнокислый двузамещенный — 0,60 г, калий хлористый — 0,07 г, кальций углекислый — 0,30 г, натрий сернистый - 0,03 г, магний сернокислый — 0,14 r, фильтрат культуральной жидкости — 30,0 мл, вода — до
100 мл.
Процедуры приготовления питательной среды, стерилизации, засева и условия культивирования аналогичны описанным в примере 1.
По окончании культивировайия титр клеток составляет(1 + 0.5) 10 кл/мл, целлюлолитическая активность по методу Хендерсона — 10 + 0,5, КМЦ-осах. активность — 2,5 +.0,1 ед/мл.
Пример 6. Посевной материал целлюлолитической бактериальной ассоциации рубца, состоящей из культур Bactегоldes
succlnogenes u Ruminococ cus flavefaclens (ассоциация М 2), готовят на питательной среде следующего состава; свекловичный жом — 0,4 r, дрожжевой автолизат — 0,02 r, аммоний сернокислый — 0,07 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный — 0,07 г, магний сернокислый — 0,006 г, калий хлористый — 0,002 r, натрий сернистый — 0,01 г, соли
ЛЖК: натрий уксуснокислый — 0,05 мг, натрий изомаслянокислый — 6,0 мг, натрий изовалериановокислый — 7,5 мг, натрий валериановокислый — 7,5 мг, вода — до 100 мл.
Процедуры приготовления среды, стерилизации, засева и условия культивирования аналогичны описанным ранее в примере 1.
Готовый посевной материал имеет титр (5 -0,5) 10 кл/мл и КМЦ-осах, активность
7 — 0,05 + 0,02 ед/мл, Для выращивания ассоциации готовят питательную среду следующего состава: свекловичный жом — 2,0 г, дрожжевой автолизат — 0,1 г, амоний сернокислый —. 0,25 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный—
Хендерсона — 5 + 0,5, КМЦ-осах. активность — 1,1 + 0,2 ед/мл.
Пример 8, Посевной материал целлюлолитической бактериальной ассоциации М
2 готовят на питательной среде следующего состава: свекловичный жом — 0,80 г, дрожжевой автолизат — 0,06 г, аммоний серно0 40 r, калий хлористый — 0,03 г, кальций углекислый — 0,10 г, натрий сернистый — 0,01
r, магний сернокислый — О;006, фильтрат культуральной жидкости — 20,0 мл, вода — до
5 100 мл.
Процедуры приготовления питательной среды, стерилизации, засева,культивирования аналогичны описайным ранее в примере 1.
10 По окончании культивирования титр клеток составляет (4 + 0,5) 10 кл/мл, целлюлолитическая активность по методу
Хендерсона — 3-4, КМЦ-осах. активность — 0,6 и 0,1 ед/мл.
15 Пример 7. Посевной материал целлюлолитической бактериальной ассоциации %
2 готовят на питательной среде следующего состава: свекловичный жом — 0,6 г, дрожжевой автолизат — 0,04 г, аммоний сернокис20 лый — 0,09 г, калий хлористый — 0,004 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный—
0,09 г, натрий сернистый — 0,02 г, магний сернокислый — 0,01 г, соли ЛЖК: натрий уксуснокислый — 0,35 мг, натрий изомасля25 нокислый — 8,0 мг, натрий изовалериановокислый — 9,5 мг, натрий валериановокислый — 9,5 мг, вода — до 100 мл.
Процедуры приготовления питательной среды, стерилизации, засева и условия куль30 тивирования аналогичны описанным ранее в примере 1.
Готовый посевной материал имеет титр (1 +0,,5) 10 кл/мл и KMЦ-осах. активность
0,1 +.0,05 ед/мл.
35 Для выращивания целлюлолитической бактериальной ассоциации рубца готовят питательную среду следующего состава: . свекловичный жом — 3.0 г, дрожжевой автолизат — 0,2 г, аммоний сернокислый — 0,35 г
40 натрий фосфорнокислый двузамещенный—
0,5 г, калий хлористый — 0,05 г, магний сернокислый — 0,01 г, кальций углекислый — 0,2
r, натрий сернистый — 0,03 г, фильтрат культуральной жидкости — 30,0 мл, вода — до 100
45 мл.
Процедуры приготовления питательной среды, стерилизации; засева и условия культивирования аналогичны описанным в примере 1.
50 По окончании культивирования титр клеток составляет (3 + 0,5) 10 кл/мл, целлюлолитическая активность по методу
1781297
16 кислый — 0,11 r, натрий фосфорнокислый двузамещенный — 0,11 r, магний сернокислый — 0,014 r, калий хлористый — 0,006 г, натрий сернистый — 0,03 г, соли ЛЖК: натрий уксуснокислый — 0,65 мг, натрий изо- 5 маслянокислый — 10,0 мг, натрий изовалериановокислый — 11,5 мг, натрий валериановокислый — 11,5 мг, вода — до 100 мл.
Процедуры приготовления питательной среды, стерилизации, засева и условия куль- 10 тивирования аналогичны описанным в примере 1.
Готовый посевной материал имеет титр (2 + 0,5) 10 кл/мл, КМ Ц-осах. активность — 0,04 + 0,02 ед/мл. 15
Для выращивания целлюлолитической бактериальной ассоциации рубца готовят питательную среду следующего состава: свекловичный жом — 4,0 r, дрожжевой автолиэат — 0,30 г, аммоний сернокислый — 0,45 20 г, натрий фосфорнокислый двузамещенный — 0,60 г, калий хлористый — 0,07 r, магний сернокислый — 0,014 r, кальций углекислый — 0,30 r, натрий сернистый — 0,03 г, фильтрат культуральной жидкости — 30,0 мл, вода — до 25 .100 мл.
Процедуры приготовления питательной среды, стерилизации, засева и условия культивирования аналогичны описанным в примере 1. 30
По окончании культивирования титр клеток составляет (4 + 0,5) 10 кл/мл, целлюлолитическая активность по методу Хендерсона — 3 0,5%, КМ Ц-осах. активность—
1,0-0,1 ед/мл. 35
Применение изобретения позволит значительно удешевить препарат активной целлюлолитической бактериальной ассоциации рубца. Так, только затраты на приготовление 1,0 м питательной среды 40 з сокращаются от 85 12 руб, до 71? руб по сравнению со способом — прототипом.
Длительность выращивания сокращается на 1 — 2 сут, использование фильтрата
55 культуральной xvpxocm rtaaeonm значительно сократить расходы на технологические нужды и объем сточных вод.
Испытания способа получения препарата активной целлюлолитической ассоциации бактерий рубца проведены в опытном цехе НПО "Биотехнология" в 1989 г. и подтверждены актом испытаний.
Формула изобретения
Способ получения препарата целлюлолитической ассоциации бактерий рубца, предусматривающий приготовление посевного материала на посевной среде, содержащей источники целлюлозы, органического и минерального азота в виде аммония сернокислого, соль фосфорной кислоты, редуктон, магний сернокислый,натрий уксуснокислый, натрий изомаслянокислый, натрий валериановокислый, натрий изовалериановокислый и воду, посев полученной культуры на пройэводственную питательную среду, содержащую источники целлюлозы, источник органического и минерального азота в виде сернокислого аммония, магний сернокислый, соль кальция, редуктон и воду, культивирование ассоциации бактерий в аназробных условиях с последующим отделением биомассы и высушиванием ее, отличающийся тем, что, с целью снижения себестоимости продукта, в качестве источников целлюлозы, органического азота и редуктона в питательных средах используют соответственно свекловичный жом, дрожжевой автолизат и натрий . сульфид, из солей фосфорной кислоты — натрий фосфорнокислый двуэамещенный, из солей кальция — кальций углекислый, при этом в каждую из сред дополнительно вносят калий хлористый, а в производственную среду дополнительно — фильтрат культуральной жидкости ассоциации бактерий, полученной после отделения биомассы в предыдущем процессе, при следующем соотношении компонентов: . посевная среда: свекловичный жом 0,4 — 0,8 r дрожжевой автолизат 0,02-0,06 г натрий фосфо рнокислый двуэамещенный 0,07-0,11 г магний сернокислый 0,006 — 0,014 r калий хлористый 0,002-0,006 r аммоний сернокислый 0,07-0,11 r натрия сульфид . 0,01-0,3 r натрий уксуснокислый 0,05 — 0,65мг, натрий иэомаслянокислый 6,0-10,0 мг натрий изовалериановокислый 7,5-11,5 мг, натрий валерианово5 кислый 7,5-11,5 мгф вода До 100 мл и производственная среда: свекловичный жом 2,0-4,0 r дрожжевой автолизат 0,1-0,3 r натрий фосфорнокислый двуэамещенный 0,4 — 0,6 r магний сернокислый 0,006 — 0,014 r калий хлористый 0,03 — 0,07 r аммоний сернокислый 0,25-0,45 r натрий сульфид 0,01 — 0,03 г кальций углекислый 0,1-0,3 r фил ьтрат кул ьтурал ь ной жидкости 20,0-30,0 мл вода До 100 мл
1781297
Таблица 1
П е агаемая с е а
Способ-и ототип.. Компоненты ена за 1 т, б.
Компоненты еназа1т, б.
500
54000
Травяная мука
Дрожжевой экстракт
Свекловичный жом
Дрожжевой автолизат
900
1000 (.
Натрий фосфорнокислый двузамещенный
Калий хлористый
1000
190
160
Кальций углекислый
Нат ий се нистый
500
310
700
350
Таблица 2
Относительные эффекты влияния уровней исследованных факторов питательной среды для ферментации ассоциации рубца.
Кон ент а ии компонентов и их э екты влияния
Компоненты акта ы
2,0
0,051
0,10
-0.018
0,25
0,023
3,5
0,097
0,25
0,070
0,40
0,041
2,5
0,095
0,15
0,066
0,30
0,037
3,0
0,11
0,20
0,072
0,35
0,045
4.0
0,063
0,30
0,056
0,45
Таблица 3
Относительные эффекты влияния уровней исследованных факторов питательной среды для выращивания посевного материала.
Кон ент а ии компонентовиихэ екты влияния
Компоненты акто ы
Свекловичный жом, Э
Дрожжевой автолизат, 7, Э
Аммоний сернокислый, Э
Натрий фосфорнокислый двузамещенный%
0,40
-0.004
0,02
0,002
0,07
0,004
0,50
0,008
0,03
0,022
0,08
0,020
0,600,010
0,04
0,039
0,09
0.029
0,70
0,009
0,05
0,027
0,10.
0,025
0,80
0,006
0.06
-0,028
0,1 1
0,012
0,07
0,006
0,09
0,018
0,010
О 025
0,08
0,014
0,008 — О,038
0,10
0,016
0,012
0,20
0,11
0,07
0,014
0,008
Магний сернокислый, Э
Пептон
Калий фосфорнокислый однозамещенный
Калий фосфорнакислый двузамещенный
Кальций хлористый
Натрий хлористый
Натрий углекислый кислый
Цистеин солянокислый
Свекловичный жом, ь
Дрожжевой автолизат, ь
Аммоний сернокислый, Э
Натрий фосфорнокислый двузамешенный, 3
Магний сернокислый, g
Кальций хлористый, Д
Натрий сернистый, 7»
Кальций углекислый, Э
0.40
0,043
0,006
- 0,03
-0,01
0,010
0,017
0,10
0,45
0,087
0,008 . 0,012
0,04
0,035
0,015
0,024
0,15
0,038
0,50
0,092
0,010
0,017
0;05
0,033
0,020
0,027
0,20
0,047
0,55
0,076
0,012
0,009
О,О6
0,028
О,О25
0,028
0,25
0,045
0,60
0,020
0,014
-0,025
0,07
0,030
-0,063
0,30
0,018
1781297
Продолжение табл. 3
Таблица 4
Накопление ЛЖК в культуральной жидкости в процессе выращивания целлюлолитической ассоциации бактерий рубца
П р и м е ч а н и е . "сл" — кислота обнаружена в следовых количествах (менее 0,1%).
Составитель Л. Кольцова
Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор В, Петраш
Редактор
Заказ 4256 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб.. 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101
Калий хлористый, %
Э
Натрий сернистый, %
Э
Кальций углекислый, %
Э
Натрий уксуснокислый, мг%
Э
Н атрий изомаслянокислый, мг%
Э "" Й
Э
Натрийвалериановокислый,мг%
0,002
0,008
0,010
0,004
0,019
0,05
0,029
6,0
0,017
7,5
0,059
7,5
0,048:
0,003
0,028
0,015
0,009
0,02
-0,034
0,20
0,098
7,0
0,058
8,5
0,072
8,5
0,117
0,004
0,036
0,020
0,013
0,04
-0,003
0,35
0,104
8,0
0,063
9,5
0,076
9,5
0,126
0,005
0,034
- 0,025
0,007
0,06
0,009, 0,50
0,089
9,0
0,060
10,5
0,075
10,5
0,12
0,006
-0,041
0,030
-0,002
0.08
0,008
0,65
0,045
10,0
0,037
11,5
-0,004
1 1,5
-0,037
