Способ определения размера фотосинтетической единицы в клетке фототрофного объекта

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (я)я G 01 N 21/25

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГOCOATFHT CCCP) ОПИСАНИЕ "ИЗОБРЕТЕНИЯ c"

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4884249/13 (22) 21,11.90 (4б) 30.12.92. Бюл. N. 48 (71) Институт почвоведения и фотосинтеза

АН СССР (72) В.А. Бойченко (56) Авторское свидетельство СССР

1Ф 1498190, кл. G 01 N 21/25, 1989. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ РАЗМЕРА

ФОТОСИНТЕТИЧЕСКОЙ ЕДИНИЦЫ В

КЛЕТКЕ ФОТОТРОФНОГО ОБЬЕКТА (57) Использование: селективное определение в физиологически активной фракции клеток биомассы фототрофных бактерий размера фотосинтетических единиц. Сущность. суспензию образца помещают в тонкослойной полярографической ячейке с

Изобретение относится к области экспериментальной биохимии и физиологии фототрофных микроорганизмов, а именно к методам определения структурно-функциональных характеристик их фотосинтетического аппарата, и может быть использовано для диагностических целей в фотобиотехнологии производства биомассы клеток бактерий с направленными изменениями эффективности утилизации световой энергии.

Наиболее близок к предлагаемому способ определения размеров фотосинтетических единиц в хлоропластах растений, включающий измерение в образцах кривых светового насыщения реакций окисления воды и фотовосстановленных переносчиков электронов с выделением и поглощением

„., SU „„1784877 А1.подводом кислорода из воздушной газовой фазы для обеспечения высокой скорости дыхания клеток. Измеряют амплитуду сигналов фотоингибирования дыхания на микросекундные вспышки света 700 нм ненасыщающей для этого процесса энергии

1,5х10 квант/см и вспышки света в диапазоне 800 — 900 нм насыщающей энергии 1-5 10 квант/см с оптимальными темновыми интервалами 2 — 5 мин. Такой выбор спектральных областей возбуждения физиологической фотореакции при измерении соотношения этих сигналов обеспечивает наибольшую точность определения оптического сечения поглощения фотосинтетических единиц, используемого для расчета их размеров по числу молекул пигмента: кислорода при облучении микросекундными вспышками.

Однако применение этого способа затруднено тем, что фототрофные бактерии 00 существенно отличаются от растений по фи- фь, зиологическим и биохимическим свойствам, QQ а также структуре фотосинтетического аппарата, Большинство типов фототрофных бактерий неспособны окислять воду с выделением кислорода, в качестве основного фотосинтетического пигмента синтезируют бактериохлорофилл с иными по сравнению с хлорофиллом растений спектральными свойствами, причем включающие этот пигмент комплексы фотосинтетических единиц в свою очередь проявляюг большую вариабельность по спектральным свойствам в зависимости or вида бактерий и условий среды при выращивании.

1784877

Y = 1 - ехр(- ZE), (1) где Y — относительная величина фотоингибирования дыхания клеток на одиночную вспышку света; Z— - оптическое сечение по- 45 глощения фотосинтетической единицы; Е— энергия вспышки света.

Размеры фотосинтетических единиц по числу содержащихся в них молекул бактериохлорофилла (N) рассчитывают из соотно- 50 шения:

N=Z o; (2) где о- оптическое сечение поглощения мо- 55 лекулы бактериохлорофилла при- данной длине волны возбуждающего света.

Длину волны возбуждающей вспышки света выбирают, чтобы обеспечить максиЦелью изобретения является расширение функциональных возможностей способа за счет селективного определения фйзиологически активного бактериохлорофилла. 5

Сущность предлагаемого способа определения размеров фотосинтетических единиц бактерий основана на возможности возбуждения специфической фотореакции посредством функционально сопряженного 10 с реака(ионнь|ми центрами светособирающего ба териохлорофйлла для последующего расчета искомой величины по измеряемым параметрам этой реакции.

Выбор процесса фотоингибирования 15 дыхания клеток бактерий как специфического показателя активности фотореакции обусловлен тем, что у этих микроорганизмов энергетика фотосинтеза и дыхания тесно взаимодействует при участии ряда 20 общих мембранных комплексов и промежуточных продуктов реакций. Поэтому функционально активные комплексы фотосинтетических единиц, в которых при возбуждении квантами света произошло разделе- 25 ние и стабилизация зарядов, влияют на перенос электронов в дыхательной цепи и, следовательно, на скорость поглощения кислорода клетками бактерий в аэробных условиях. 30

Зависимость относительной величины фотоингибирования дыхания от энергии вспышки света микросекундной длительности (в течение этого времени возможно только однократное разделение зарядов в 35 реакционных центрах) должна соответствовать теории одноударного попадания в миlll8Hb квантов света и описываться экспоненциальным уравнением: мальную точность определения размеров фотосинтетической единицы. С этой целью эффективность реакции фотоингибирования дыхания измеряют в спектральной области, где коэффициент экстинции бактериохлорофилла, во-первых, имеет малую величину и, следовательно, минимальны эффектьг неравномерного поглощения света клетками, во-вторых, этот коэффициент слабо зависит от видовых или адаптивных изменений состава пигмент-белковых комплексов мембран бактерий.

Переходный процесс фотоингибирования дыхания у клеток бактерий на одиночную микросекундную вспышку света протекает за короткое время (несколько секунд), а величина скорости реакции сравнительно мала, причем зависит не только от энергии вспышек света, но и темновых интервалов между ними, а также физиологических условий в среде (в частности, от концентрации кислорода). Поэтому к системе регистрации скорости газообмена кислорода у образца бактерий предъявляются повышенные требования в отношении чувствительности, быстродействия и стабильности условий среды, Эти необходимые характеристики обеспечивает специальная модификация полярографического устройства для измерения концентрации кислорода в растворах.

Расположение клеток бактерий на горизонтальной поверхности платинового электрода в пределах диффузионного слоя реакции электровосстановления кислорода локализует минимальный объем раствора (несколько десятков микролитров), в котором происходят изменения равновесной концентрации кислорода, пропорциональные скорости биологического процесса.

Этот принцип устройства полярографической ячейки повышает на несколько порядков .ее чувствительность и уменьшает инерционность. Вместе с тем, для того, чтобы предотвратить лимитирование дыхания бактерий недостатком кислорода и переход их к анаэробному метаболизму, необходимо стабилизировать толщину диффузионного слоя и оптимальную локальную концентрацию кислорода в месте расположения клеток. С этой целью в объеме полярографической ячейки над мембраной, фиксирующей образец в тонком слое раствора на платиновом электроде, оставляют воздушную газовую фазу (электрод сравнения должЕн располагаться в буферном растворе ниже этого уровня, чтобы обеспечивалась электрическая замкнутость цепи). Кроме того ограничивают концентрацию клеток в образце, чтобы они в среднем образовывали

1784877

6 монослой на измерительном электроде(этому условию обычно соответствует оптическая плотность образца не более 0,1-0,2 в области максимума поглощения), Оптимальную длительность темновых 5 интервалов между микросекундными вспышками свега, которая ойределяет точность сравнения измеряемых йолярографических сигналов, оценивают по времени затухания осцилляций величины фотоинги- 10 бирования дыхания на отдельные. вспышки при установлении равновесия редокС-cостояния цепи переносчиков электрбнов в мембранах бактерий, Способ осуществляется в следующей 15 последовательности.

1.Образец суспензии клеток бактерий помещают на поверхность платинового электрода в слое 0,5 мм с оптической плотностью 0,1 — 0,2. 20

2.Полярографическую ячейку частично заполняют буферным раствором, чтобы обеспечивался электрический контакт между парой электродов, но оставался слой воздуха над целлофановой мембраной, 25 фиксирующей образец на платиновом электроде.

3.Записывают полярографические сигналы фотоингибирования потребления кислорода клетками бактерий под воздей- 30 ствием микросекундных вспышек света на сыщающей энергии в области 800-900 нм, а также вспышек света известной ненасыщающей энергии в области 700 нм с темновыми интервалами 2 мин, 35

4.Измеряют соотношения амплитуд этих сигналов для расчета размеров фотосинтетических единиц в клетках бактерий.

Способ реализуют на модульной установке, включающей полярографическое ус- 40 тройство с системой регистрации тока электровосстановления кислорода и импульсный источник освещения 4. В качестве стабильного источника импульсов света микросекундной длительности с достаточно 45 высокой энергией и широким спектром излучения используют строботрон NCLU-100ЗМ, Необходимую спектральную область возбуждения измеряемой фотореакции выделяют интерференционным светофильт- 50 ром или комбинацией граничных светофильтров. Энергию монохроматической вспышки света измеряют радиациой-"" ным термоэлементом РТН-20 С.

Пример 1. Культуры пурпурных бактерий Rhodobacter capsulatus u Rhodo-0

splrlllum rubrum выращивают 2 сут в безкислородной жидкой среде с малатом (составы

Хатнера и Ормеруда) при 28 С и непрерывном освещении 2000 лк от ламп накаливания, На поверхность платинового электрода площадью 30 мм микропипеткой наносят г

20 мкл суспензии клеток бактерий, образующей слой 0,65 мм с оптической плотностью

0,1 — 0,2 при 880 нм, и фиксирую его целлофановой мембраной. Полярографическую ячейку заполняют раствором 0,05 М КС! и

0,05 M фосфатного буфера рН 6,8 до уровня нижней границы этой мембраны, оставляя над ее внешней поверхностью до оптического окна слой воздуха, Регистрируют ток электровосстановлейия кислорода на платиновом электроде г ри потенциале -0,6 В относительно хлорсеребряного электрода сравнения.

Образец последовательно освещают микросекундными вспышками света в спектральной области 800-900 нм (энергия вспышки 4х10 квантов/см ) и 700 нм (1,87х10 квантов/см ) с темновыми интер14 г валами 2 мин и записывают полярографические сигналы импульсов тока обратимых изменений концентрации кислорода в слое клеток бактерий, Для повышения точности измерений отношения амплитуд этих сигналов воспроизводят AeCicoiiiько повторностей воздействия этих пар вспышек света.

По величине отношения амплитуд сигйалов фотоингибирования дыхания на вспышке ненасыщающей (в области 700 нм) и насыщающей для этого процесса энергии (в области 800-900 нм) рассчитывают оптическое сечение поглощения фотосинтетической единицы бактерий при 700 нм, используя логарифмированную форму уравнения 1.

Например, в образце клеток R,capsu

latus зарегистрирована относительная величина сигнала фотоингибирования дыхания на вспышку света в области 700 пм равная 0,19. Расчетоптического сечения поглощения фотосинтетической единицы:

o = -1л(1 — 0,19)/1,87х10 о = 1,12х10 смг = 11,2 Ао

Согласно известным данным, оптическое сечение поглощения молекулы бактериохлорофилла в пигмент-белковых комплексах мембран бактерий составляет при 700 нм 0,21 А . Подставляя эту величиг ну в уравнение 2, рассчитывают размеры фотосинтетической единицы:

N = 11,2/0,31 = 53

В сериях измерений из и> ти биологических повторностей на различных культурах клеток Rhodobacter capsulatus эта величина составляет 51+6, а в клетках Rhodosplrlllum

rubrum 29+4 молекул бактериохлорофилла.

1784877

Составитель В.Пиунова

Техред М.Моргентал Корректор

М.Ткач

Редактор Т.Горячева

Заказ 4360 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул,Гагарина, 101

В аналогичных измерениях на культуре бактерий Rhodopseudomonas palustrls штамма АБ, выращенных при низких(200лк) и высоких (20000 лк) освещенностях, размеры фотосинтетических единиц составляют

104+13 и 41+4 молекулы бактериохлорофилла.

Таким образом, способ позволяет диагностировать видовые различия и адаптивные изменения под действием факторов внешней среды размеров фотосинтетических единиц в клетках фототрофных бактерий.

Предлагаемый способ определения размеров фотосинтетических единиц в клетках фототрофных бактерий имеет ряд существенных преимуществ по сравнению с известным спектроскопическим методом, основанным на измерениях стехиометрических соотношений двух различных фракций бактериохлорофилла, Во-первых, измерительная процедура сводится к экспериментальному определению только одного численного параметра вместо двух, что упрощает и ускоряет проведение анализов образцов, Во-вторых, определяемый параметр не зависит от присутствия в образце функционально негативного бактериохлорофилла, что повышает точность измерений по сравнению с известным способом. Высокая селективность предлагаемого способа к диагностированию структурнофункциональных свойств пигментного аппарата физиологически активных клеток позволяет испольэовать его для прижизненного экспресс-анализа биомас5 сы фототрофных микроорганизмов в фотобиотехнологических реакторах.

Формула изобретения

Способ определения размера фотосинтетической единицы в клетке фототрофного

10 объекта, предусматривающий облучение клетки микросекундн ыми всп ы ш ками света, регистрацию физиологического параметра клетки и расчет размера фотосинтетической единицы по формуле, отличающийся

15 тем, что, с целью расширения функциональных возможностей способа за счет селективного определения физиологически активного хлорофила, перед облучением объекта суспензию клеток помещают на по20 верхность платинового электрода в тонкослойной полярографической ячейке с воздушной газовой фазой над мембраной, фиксирующей суспензию клеток, облучение клеток осуществляют последовательно све25 том длиной волны 700 нм и 800 — 900 нм ненасыщающей энергией 1 — 5.10 квантов/ см и более 10 квантов/см, соответствен, г но с темновыми интервалами от 2 до 5 мин, после чего регистрируют сигналов фотоин30 гибирования дыхания у клеток, а в качестве физиологического параметра используют соотношение амплитуд сигналов.