Способ отбора сырья для получения антилептоспирозной плазмы

 

Использование: медицина, аллогенный препарат, профилактика и лечение лептоспироза. Сущность изобретения: скринируют кровь практически здоровых донороспособных лиц для выявления высоких (1:160-1:320) антител к лёптоспирам, в реакции пассивной гемэгглютйнацми с лептоспирозным поливалентным эритроцитарным диагностикумом повышенной чувствительности. Полученная антилептоспирозная плазма в л;иофилизированной форме обладает специфической активностью . 2 табл.

СОЮЗ CORE ÒÑÊÈÕ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК 4Му: (51)s А 61 К 39/40

ГО УДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

BE OMCTBO СССР (госпАтент сссР) бПИСЛНИЕ ИЗОЬРЕТЕНИЯ

К ABTOPCKOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ ! (21) 4854963/13 (22) 27.07.90 (4ф) 07.02.93. Бюл. М 5 (71) Киевский научно-исследовательский институт гематологии и переливания крови, Кйевский научно-исследовательский институ(г эпидемиологии и инфекционных болезн и им,Л.В.Громашевского (72) Л.В.Назарчук, Е.В,Мельницкая, В,Н;Кондратенко, E,А.Федоровская и Е.П.Бернасовская (56) Терских В.И. Серотерапия эпидемического лептоспироза районов Московской области/Микробиология, 1935, т.15, ¹4, с,589 †5, Лептоспирозы. Тез,докл. Vill Всесоюз. кОнф. по лептоспирозам, Тбилиси, 1983, с„267, Изобретение относится к области медйцины, а именно, к способам получения и4мунных препаратов из крови человека, и к ожет быть использовано в производственной трансфузиологии.

Лептоспироз является инфекционным заболеванием, характеризующимся тяжелым течением, летальность при котором в

Некоторых регионах мира достигает 48%.

В комплексном лечении больных лепTîñïèðîçîì применяется плазма человеческая нормальная и ксеногенный

Иммуноглобулин, полученный из крови гиг(ериммунизированных волов.

В основе способов получения этих препаратов лежит либо скринирование исходйых сывороток крови, либо активная

Иммунизация доноров крови соответствующими вакцинами или анатоксинами. Последний способ трудоемок, требует наличия Ы„, 1792709 Al.(54) СПОСОБ ОТБОРА СЫРЬЯ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ АНТИЛЕПТОСПИРОЗНОЙ ПЛАЗМЫ (57) Использование: медицина, аллогенный препарат, профилактика и лечение лептоспироза. Сущность изобретения: скринируют кровь практически здоровых донороспособных лиц для выявления высоких (1:160 — 1:320) антител к лептоспирам, в реакции пассивной гемагглютинации с лептоспирозным поливэлентным зритроцитарным диагностикумом повышенной чувствительности. Полученная антилептоспирозная плазма в лиофилизировэнной форме обладает специфической активностью, 2 табл. коммерческих вакцинных препаратов и организации многочисленного контингента а доноров-добровольцевдля проведенияспецифической иммунизации.

Задачей изобретения является получение аллогенного антилептоспирозного препарата с высокой специфической активностью и стабильностью, l С)

Способ осуществляется следующим образом.

Готовят лептоспирозный поливэлентный эритроцитарный диагностикум повышенной чувствительности, с его помощью проводят скрининг индивидуальных образцов сыворотки крови здоровых лиц в реакции пассивной гемагглютинации для выявления антилептоспирозных антител.

Кровь доноров, в сыворотке которых выявлены антитела в титрах 1;160 и выше, является источником получения аллогенной

1792709. антилептоспирозной плазмы в жидкой, замороженной и лиофилизирован ной формах, Пример 1. Готовят лептоспирозный поливалентный эритроцитарный диагностикум повышенной чувствительности из ряда штаммов лептоспир, обладающих подвижностью, типичной морфологией, хорошим ростом на питательной среде, агглютинирующихся типоспецифической иммунной сывороткой до титра не менее чем 1:10000.

Для получения бактериальной массы маточную культуру каждого штамма засевают во флаконы со средой Терских в соот-ношении 1;10 и выращивают при 28"С и течении 10-14 дней, Примеси белка питательной среды удаляют центрифугированием через четырехслойный марлевый фильтр.

Взвесь бактерий центрифугируют при

6000 об/мин в течении 40 мин при 80 + 2 С.

Биомассу ресуспендируют в 0,9% растворе натрия хлорида до конечной концентрации

50 10 мг/мл, Рабочую взвесь клеток каждого штамма в объеме 50 мл для выделения антигена озвучивают в аппарате УЗДН-1 в следующем режиме: частота 44 .кГц, сила тока 0,7 — 0,8 Ма. продолжительность озвучивания 3 и 1 мин, температура 15 3 С.

После озвучивания взвесь центрифугируют при 6000 об/мин в течении 40 мин при.

8 2 С. Из раствора. каждого моноантигена отбирают пробу в объеме 3 мл для определения сенсибилизирующей активности.

Сенсибилизирующую активность антигена проверяют в дозах 0,01 мг/мл

0,05 мг/мл путем сенсибилизации ими танизированных формалинизированных эритроцитов барана, Антиген считают годным, если сенсибилизирующая активность не превышает 0,05 мгlмл взвеси 2,5% эритроцитов., Моноантигены штаммов объединяют в полиантиген в обьемах обратно пропорциональных их гомосенсибилизирующей активности. Общий объем в дальнейшем именуемый "серией" должен быть не менее

100 мп.

Серию поливалентного антигена разливают в стерильные пробирки по 5 мл, закры-. вают резиновыми пробками и сохраняют .при -20 С. Срок хранения антигена — 6 месяцев.

Необходимое дпя приготовления диагностикума количество формалинизированных 10% эритроцитов барана отбирают в пробирки по 2 мл. Осаждают и отмывают

4 — кратным центрифугированием при

1000 об/мин в течении 15 мин от остатков формалина раствором нормальной кроличьей сыворотки 1:250 в 0,9% растворе натрия хлорида рН 6,8 : "0,05, Эритроциты разводят до концентрации 2,5% взвеси

0,9% раствором натрия хлорида рН 6,8 «+.

0,05, прогретым при 37 С.

К 2,5% взвеси отмытых формализированных эритроцитов, постоянно помешивая, добавляют равный объем танина

1:20000, предварительно подогрев его до

37 С. Танизацию проводят при 37 С + 1 С

"0 .в течении 15 минут. По окончании танизации взвесь зритроцитов трехкратно отмывают забуференным 0,9% раствором натрия хлорида рН 6,4 0,05, центрифугируя по 10 мин, при 1000 об/мин, Осадок после центрифугирования разводят этим же забуференным раствором до 2,5% концентрации зритроцитов, К 2,5% взвеси танизированных эритроцитов при перемешивании добавляют равный объем раствора лептоспирозного антигена в оптимальной сенсибилизирующей дозе, выдерживают при 45 + 1 60 мин на водяной бане.

К смеси формалинизированных эритроцитов с сенситином для более прочного связывания лептоспирозного антигена с рецепторами эритроцитов добавляют формалин до 1,0% конечной концентрации за

15 мин до конца сенсибилизации.

Взвесь сенсибилизированных эритроцитов осаждают центрифугированием *при

1000 об/мин в течение 15 мин, Остатки сенситина, не связывающегося с рецепторами эритроцитов, удаляют 4 — кратным отмыванием на центрифуге в том же режиме раствбром нормальной кроличьей сыворотки из расчета 25-кратного объема к осадку эритроцитов.

Осадок сенсибилизированных эритро40 цитов после отмывания разводят до 5,0% концентрации эритроцитов раствором нормальной кроличьей сыворотки в разведении

1:250. Готовый жидкий диагностикум консервируют добавлением формалина до конечной концентрации 2,0%.

Образец плазмы крови донора исследуют на наличие антилептоспирозных антител в реакции пассивной гемагглютинации.

Титр выявленных в образце плазмы ан50 тилептоспирозных антител составляет

1:160. В реакции с цистеином установлено, что антилептоспирозные антитела относятся к иммуноглобулинам класса G. Плазму крови данного донора подвергают лиофильному высушиванию.

Пример 2. Готовят пептоспирозный эритроцитарный диагностикум повышенной чувствительности способом, описанным в примере 1. Образец плазмы крови

1792709

Плазма крови с титром 1:160-1:320 ан- тилептоспирозных антител выявляется у здоровых лиц в 6% случаев. Плазма крови с титрами антилептоспирозных антител, уровень которых ниже, чем 1:160 не может считаться антилептоспироэной, т.к. она обладает низкой специфической активностью. Плазма крови с титром антилептоспирозных антител, превышающим 1;320, встречается крайне редко, поэтому ее отбор в качестве специфического препарата нереален.! донора исследуют на наличие антилептосЙирозных антител в реакции пассивной ге4агглютинации.

Титр выявленных антилептоспироэных нтител составляет 1:256, Плазму крови 5 энного донора лиофильно высушивают.

Пример 3. Лептоспирозный эритроцитарный диагностикум повышенной чувствительности и выявление антилептосЙирозных антител проводят аналогично 10 г1римерам 1 и 2. Титр выявленных антилепт оспирозных антител составляет 1:320. лазму крови данного донора лиофильно высушивают.

Протективное действие антилептоспи- 15 озной плазмы исследовали in vivo на морских свинках (табл.1), массой 190-200 r, которых предварительно заражали внутри, брюшинно культурой лептоспир в дозе

2 10 клеток, относящейся к серогруппе 20

Ictегоhaemorrhagiae.

В результате проведенных исследов ний оказалось, что наибольшей прот ктивной активностью обладала сухая ч ловеческая антилептоспирозная плазма. 25

Заявляемый способ позволил впервые получить аллогенную антилептоспирозную плазму в жидкой, замороженной и лиофилизированной формах, характеризующихся уровнем титров антилептоспирозйых антител 1:160 — 1:320, относящихся к иммуноглобулинам класса G, стабильно сохраняющую специфическую активность в жидкой форме—

72 часа при температуре 6-2 С; в замороженной форме — 6 месяцев при температуре

-25 + 5 С; в лиофилизированной форме — 2 года при температуре 20 — 2 С (табл.2).

Таблица1

Протективная эффективность антилептоспирозной плазмы 0

Вводимый препарат

Группы животных

Количество животных мо ские свинки всего пало выжило

Человеческая (сухая) антилептоспирозная плазма

Нормальная человеческая плазма

Антилептоспирозный воловий гамма-гл обул ин

Без введения препаратов

Интактные животные

Опыт

Контроль

IIl

Формула изобретения скринирование крови здоровых лиц с исСпособ отбора сырья для получения ан- 30 пользованием лептоспиразного поливалент лептоспирозной плазмы путем скриниро- тного эритроцитарного диагностикума и в ния крови людей, отличающийся отбирают образцы плазмы с титром антит м, что, с целью повышения активности и лептоспирозных антител 1:160 — 1;320, отностабильности целевого продукта, проводят сящихся к иммуноглобулинам класса G.

1792709

Таблица2

Специфическая активность сухой антилептоспирозной плазмы в процессе хранения

Составитель Л.Назарчук

Техред М.Моргентал Корректор Н,Король

Редактор Л.Волкова

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

Заказ 469 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб,, 4/5