Способ получения иммунной сыворотки к риккетсиям провачека
Использование медицина, микробиология , диагностические исследования. Сущность изобретения куриные эмбрионы, погибшие на 4 - 6-е сутки после заражения, вскрывают, извлекают желточные мешки, готовят 10%-ную маточную взвесь. Инактивируют ее в течение 10-12 сут 0,5%-ным фенолом при 4иС. Экстрагируют эфиром в течение 18 ч, выделяют тканевую фазу. В тканевую фазу добавляют фенол до 2 - 3% концентрации, прогревают при 100°С в течение 20 мин, потом вновь экстрагируют эфиром, выпаривают, а к полученному осадку добавляю равный объем ацетона. Смесь прогревают при 55°С в течение 1 ч, после чего ацетон удаляют, а осадок растворяют в хлороформе и получают таким образом фосфолипидный антигенный комплекс. Иммуногенноесредствоготовят диспергированием 4 кг фосфолипидного антигенного комплекса активностью 80-160 А.Е. в 0,5 мл химической сыпнотифозной вакцине, содержащей 48 АЕ Получение суспензии белого цвета свидетельствует о образовании липосом. Однократная иммунизация животных этими липосомами позволяет получать сыворотки с высоким титром. 1 табл. Ј
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК (si)s А 61 К 39/40, 39/118
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ
ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ
ПРИ ГКНТ СССР
ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (Ы
О !
О
1 (21) 4779315/13 (22) 09.01.90 (46) 15.05,92. Бюл,¹18 (71) Пермский государственный медицинский институт и Пермский научно-исследовательский институт вакцин и сывороток
Научно-производственного объединения
"Биомед" (72) О,А.Тимашева и Э,С.Горовиц (53) 615.373 (088,8) (56) Паутов В.Н., Лукин E.Ï., Воробьев А.А.
Специфическая профилактика риккетсиозов. М,: Медицина, 1969, с. 199. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИММУННОЙ
СЫВОРОТКИ К РИККЕТСИЯМ ПРОВАЧЕКА (57) Использование; медицина, микробиология, диагностические исследования. Сущность изобретения: куриные эмбрионы,. погибшие на 4 — 6 е сутки после заражения, вскрывают, извлекают желточные мешки, готовят 10%-ную маточную взвесь. ИнактиИзобретение относится к медицине, к медицинской микробиологии, и может быть использовано для получения специфических иммунных сывороток к риккетсиям
Провачека, которые применяются для диагностики эпидемического сыпного тифа и болезни Брилля.
Известен способ получения иммунных сывороток к риккетсиям Провачека с использованием в качестве иммуногенного средства химической сыпнотифозной вакцины.
Однако этот способ не позволяет получить иммунные сыворотки с высокой специфической активностью, „„Я3 „„1733004 А1 вируют ее в течение 10 — 12 сут 0 5%-ным фенолом при 4"С. Экстрагируют эфиром в течение 18 ч, выделяют тканевую фазу. B тканевую фазу добавляют фенол до 2 — 3% концентрации, прогревают при 100 С в течение 20 мин, потом вновь экстрагируют эфиром, выпаривают, а к полученномуосадку добавляю равный объем ацетона. Смесь прогревают при 55ОС в течение 1 ч, после чего ацетон удаляют, а осадок растворяют в хлороформе и получают таким образом фосфолипидный антигенный комплекс. Иммуногенное средство Готовят диспергированием 4 кг фосфолипидного антигенного комплекса активностью 80 — 160
А.Е, в 0,5 мл химической сыпнотифозной вакцине, содержащей 48 АЕ. Получение суспензии белого цвета свидетельствует о образовании липосом. Однократная иммунизация животных этими липосомами позволяет получать сыворотки с высоким титром, 1 табл.
Цель изобретения — повышение специфической активности иммунных сывороток, что даст возможность улучшить качество целевого продукта, значит, более эффективно осуществлять лабораторную диагностику эпидемического сыпного тифа и болезни
Брилля.
Укаэанная цель достигается тем, что для иммунизации лабораторных животных используют химическую сыпнотифозную вакцину, конъюгированную с фосфолипидным антигенным комплексом риккетсий Провачека. Соотношение ингредиентов: 0,5 мл вакцины, содержащей 48 антигенных единиц (АЕ) и 54- мг фосфолипидного антигенного комплекса, содержащего 80 — 240 АЕ, 1733004
В состав иммуногенного средства дополнительно вводят фосфолипидный антигенный комплекс риккетсий Провачека, на основе которого готовят липосомы, инкапсулирующие сыпнотифозную вакцину, Объем вакцины 0,5 мл со специфической активностью 48 АŠ— форма выпуска коммерческого препарата, разовая доза химической сыпнотифозной вакцины, используемая для иммунизации. Концентрация фосфолипидного антигенного комплекса
5 +. 1 мг со специфической активностью 80 — 240 АЕ обеспечивает максимальный положительный эффект, Способ осуществляют следующим образом.
Инфицированные риккетсиями Провачека куриные эмбрионы, "специфически" погибшие на 4 — 6 сут после заражения вскрывают, Извлекают желточные мешки и тщательно гомогенизируют в колбе со стеклянными бусами. Готовят 10%-ную маточную суспензию на физиологическом растворе рН вЂ” 7,0. Для инактивации возбудителя добавляют фенол в конечной концентрации 0,5% и выдерживают 10 — 12 сут при+4 С. Затем полученную суспензию заливают наркозным эфиром, соотношение эфира и материала 1,5:1,0, Колбы помещают в рефрижератор при+4 С на 18 ч, после чего наблюдается расслоение исходной суспензии на 3 слоя, Поверхностный эфирный слой переносят в стеклянную колбу с бусами.
Тканевую фазу переносят в другую стерильную колбу с бусами, постепенно нагревают на водяной бане до 50 — 65 С до полного удаления эфира (исчезновение запаха), охлаждают до 18 — 25 С и добавляют фенол до
2 — 3%-ной концентрации, вновь постепенно нагревают на водяной бане до 100 С и выдерживают в течение 20 мин при этой температуре, затем остужают и вновь заливают наркозным эфиром. Соотношение эфира и материала 10:1. Колбы выдерживают при 4 С в течение 2 — 16 ч, Затем эфир переносят в колбу с эфирной фракцией, полученной при расслоении исходной суспензии; приготовленную эфирную смесь выпаривают при частичном вакууме с помощью специального аппарата при 40—
42 С. К полученному осадку добавляют равный объем химически чистого ацетона. Материал помещают на водяную баню при
55 С на 1 ч, после чего ацетон удаляют.
Приготовленный осадок растворяют в хлороформе из расчета 0,1 мл на 1 желточный мешок, Из полученного раствора берут выемку для определения сухого веса и серологической активности по реакции связыванияя ком пл е мента (PC Ê). Хлороформ
50 тщательно отгоняют в токе азота. Определив сухой вес и активность фосфолипидного антигенного комплекса в PCK по иммунной гомологичной сыворотке, вычисляют его удельную серологическую активность (УСА) на 1 мг сухого веса. Ее определяют отношением титра фосфолипидного антигенного комплекса по PCK к сухому весу, Иммуногенное средство готовят тщательным диспергированием с помощью шприца 4 мг фосфолипидного антигенного комплекса активностью 80 — 160 АЕ в 0,5 мл химической сыпнотифозной вакцины, содержащей 48 АЕ. Приобретение системой белого цвета свидетельствует о липстропном метаморфозе — образовании липосом.
Приготовленное иммуногенное средство вводят однократно внутримышечно лабораторным животным (кроликам, морским свинкам). В результате получают выраженные сероконверсии у иммунизированных животных (см,таблицу), Уровень накопления специфических антител в сыворотках иммунизированных животных в зависимости от концентрации и содержания AE фосфолипидного антигенного комплекса в иммуногенном средстве приведен в таблице, Наиболее качественный конечный продукт получали при концентрации в иммуногенном средстве фосфолипидного антигенного комплекса 5 4- 1 мг активностью 80 — 240 АЕ, Фосфолипидные антигенные комплексы риккетсий Провачека с УСА более, чем 40
АЕ на 1 мг не удается извлекать из овокультур, Использование для приготовления иммуногенного средства фосфолипидных антигенных комплексов с УСА менее, чем 10
АЕ на 1 мг не обеспечивает получения иммунных сывороток с достаточно высокой специфической активностью. В свою очередь увеличение в иммуногенном средстве концентрации фосфолипидного антигенного комплекса до 7 мг и выше ведет к длительному его депонированию и образованию абсцессов у иммунизированных животных, Положительный эффект от использования изобретения заключается в получении иммунных сывороток к риккетсиям Провачека с высокой специфической активностью, лишенных тканевого балласта. При этом иммунные высокотитровые сыворотки можно получить при однократном введении иммуногенного средства.
Формула изобретения
Способ получения иммунной сыворотки к риккетсиям, Провачека, включающий иммунизацию животных химической сыпнотифозной вакциной с последующим отбором крови и выделением целевого продукта, о т1733004 сом риккетсий Провачека с активностью 80 — 240 АЕ из расчета 5 1 мг на одну дозу вакцины. л и ч а ю шийся тем, что, с целью повышения специфической активности сыворотки, для иммунизации используют смесь вакцины с фосфолипидным антигенным комплек5
Максимальный титр антител у иммунизированных лабо ато ных животных
УСА серий препарата
Концентрация фосфолипидного антигенного ком пл.
Антигенная активность (АЕ) мо ские свинки к олики
PCK
РНГА
РНГА
РСК
3мг
4мг.5 мг
6мг
П р и м е ч а н и е: титры антител даны в виде обратных величин средней арифметической по 5 кроликам и 10 морским свинкам в каждой серии опытов, 10
20
Составитель Э, Горовиц
Техред M. Моргентал Корректор С. Шевкун
Редактор А. Долинич
Заказ 1617 Тираж Подписное
ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101
240
52
54
54
76
76
124
124
128
96
124
128
128
96
128
128
124
248
288
248
288
502
502
502
502
502
525
86
96
108
144
147
147
108
147
144
147
108
144
144
144
196
196
256
256
256
256
256
256
256
