Способ определения нуклеотидной последовательности днк и устройство для его осуществления

 

Использование: молекулярная биология, в частности определение последовательности нуклеотидов в ДНК методом гибридизации . Сущность изобретения: на стеклянной подложке формируют матрицу из геля-носителя , наносят набор нуклеотидов, проводят гибридизацию с меченной тестируемой ДНК, гибридизацию и отмывку проводят при одинаковой температуре и определяют одиночные замены оснований в тестируемой ДНК по анализу распределения метки. Устройство для осуществления способа представляет собой стеклянную подложку и матрицу, представляющую собой одинаковые участки геля толщиной 10-30 мкм с наибольшей длиной 25-100 мкм с расстоянием между участками, равным удвоенной наибольшей длине. 2 с.п. ф-лы, 7 ил. 1 табл. ел

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ Лэ., "- « (21) 4919321/13 (22) 18.03.91 (46) 07.02,93, Бюл. ¹ 5 (71) Институт молекулярной биологии им.

В,А.Энгельгардта (72) К.Р,Храпко, А.А,Хорлин, И.Б.Иванов, Г. М, Ершов, Ю. П,Л ысо в, В,Л. Флоре нтьев и

А.Д.Мирзабеков (73) Институт молекулярной биологии АН

СССР (56) Conon R,G.Н. //Biochem. 1. 1989, ч, 263, рр. 1-10, Wallace et al, //Nucleic Acid. Res., 1979, ч. 6, рр, 3543-3557.

РСТ/GB 89/00460, 1989, С 12 Q 1/68. (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НУКЛЕОТИДНОЙ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТИ ДНК И

УСТРОЙСТВО ДЛЯ ЕГО ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

Изобретение относится к молекулярной биологии, в частности к определению последовательности нуклеотидов в ДНК методом гибридизации, Известен ряд методов анализа нуклеотидной последовательнбсти и распознавания одиночных замен оснований при помощи гибридизации.

Распространенными являются методики, которые заключаются в том, что тестируемый фрагмент ДНК закрепляют на мембране и гибридиэуют с меченными олигонуклеотидами.

Наиболее близким к заявляемому является способ и устройство для определения нуклеотидной последовательности ДНК, „„ Ы„„1794088 А3 (si)s С 12 Q 1/68, С 12 N 15/00 (57) Использование: молекулярная биология, в частности определение последовательности нуклеотидов в ДНК методом гибридизации. Сущность изобретения: на стеклянной подложке формируют матрицу из геля-носителя, наносят набор нуклеотидов, проводят гибридизацию с меченной тестируемой ДН К, гибридизацию и отмывку npoBoäÿò при одинаковой температуре и определяют одиночные замены оснований в тестируемой ДНК по анализу распределения метки. Устройство для осуществления способа представляет собой стеклянную подложку и матрицу, представляющую собой одинаковь:е участки геля толщиной 10-30 мкм с наибольшей длиной 25 — 100 мкм с расстоянием между участками, равным удвоенной наибольшей длине, 2 с.п, ф-лы, 7 лл, 1 табл. включающий синтез олигонуклеотидов длиной от 8 до 20 нуклеотидов на стеклянной подложке-носителе, проведение гибридизации с радиактивно или флуоресцентно меченной тестируемой ДНК, определение наличия одиночных замен в исследуемой последовательности по анализу радиографического рисунка или интенсивности флуоресценции в отдельных точках.

Однако известный способ не обладает достаточно высокой чувствительностью, громоздок, так как требует в случае анализа даже фрагмента тестируемой ДН К проведения ряда последовательных гибридизаций и соответственно последовательного досинтезирования используемой матрицы олиго1794088 нуклеотидов с ша ом в одну букву во всех точках, где гибридизация не дает однозначной информации о последовательности, при этом каждый раз выбор новых оптимальных условий гибридизации (температуры, концентраций реагентов и т.д.) требует дополнительных значительных затрат при том, что упомянутые операции плохо или вообще не поддаются автоматизации, Целью изобретения является повышение чувствительности, точности и воспроизводимости способа и устройства, упрощение определения известных точечных мутаций в нуклеотидной последовательности, снижение затрат и возможность. автоматизации процессов, Поставленная цель в способе доститается тем, что меченную тестируемую ДНК гибридизуют со всем набором олигонуклеотидных проб, иммобилизованных в ячейки геля-носителя, нанесенного на подложку, гибридизацию и отмывку проводят при одинаковой температуре, Поставленная цель в устройстве достигается тем, что матрица представляет собой одинаковые участки геля толщиной 10-30 мкм, наибольшей длиной 25 — 100 мкм и с . расстоянием ме>кду участками, равным удвоенной наибольшей длине.

Способ осуществляют следующим образом, Два предметных стекла, одно из которых предварительно обрабатывают Bind

Silane, а другое - Repel Юапе и покрывают тонким слоем TritonX-100, устанавливают дистанционно с помощью прокладок толщиной 10-30 мкм, образованный зазор в "сэндвиче" заполняют гелеобразующим раствором и оставляют до полного гелеобразования, После этого верхнее стекло снимают. Стекло со слоем геля обрабатывают

50 -ым раствором гидразина, подсушивают, часть геля удаляют так, что на поверхности стекла остаются одинаковые участки-ячейки геля с наибольшей длиной

25-100 мкм и промежутками между ними, равными удвоенной наибольшей длине. .Полученную поверхность обрабатывают в течение 2-5 мин Repel Sllane, промывают спиртом, затем бидистиллятом и высушивают, Олигодезоксинуклеотиды, содержащие на 3 -конце З-митилуридин, окисляют 1 мМ периодатом натрия в течение 10 мин — 1 ч и ри комнатной температуре, осаждают 10-ю объемами 2 -го LiCI04 в ацетоне и растворяют в воде. Из необходимого набора в ячейки воздушно сухой матрицы наносят одинаковые по объему микродозы окисленных олигонуклеотидов, причем в каждую ячейку строго одного типа. При этом их концентрации в микродозах различны и подобраны так, что соответствуют одинаковой оптимальной температуре гибридизации и плавления совершенных дуплексов, образованных иммобилизованными олигонуклеотидами с фрагментами ДНК. Гибридизацию флуоресцентно или радиоактивно меченных фрагментов тестируемой ДНК проводят при оптимальной температуре и влажности, нанося ее на поверхность матрицы. Определяют наличие одиночных замен в исследуемой последовательности по анализу радиографического рисунка или интенсивности флуоресценции в отдельных ячейках.

На фиг.1 представлено устройство в разрезе (позиция а) и вид сверху (позиция б); стеклянная подложка 1, ячейки 2 геля, Способ поясняется следующим:

На фиг,2 — схема химических реакций

20 при иммобилизации олигонуклеотида в полиакриламидный гель-ПААГ; на фиг,3 — кривые отмывки AT-богатых (позиция а) и

GC-богатых (позиция б) дуплексов (мисматчи выделены жирным шрифтом; М вЂ” матрица); на фиг.4 — зависимость отмывки дуплекса (показан вверху рисунка, М вЂ” матрица) от концентрации иммобилизованного олигонуклеотида. В пятне объемом 0,03 мм иммобилизовано 5 (1), 1,5 (2), 0,5 (3) и 0,15 (4)

30 пмоль олигонуклеотида; на фиг.5 — уравнивание температур отмывки AT-богатых и GCбогатых дуплексов путем подбора концентраций олигонуклеотидов, иммобилизованных в геле. (Структура дуплексов и концентрации иммобилизованных олигонуклеотидов приведены на фиг,5 справа; М вЂ” матрица); на фиг.6 — обнаружение мисматчей в дуплексах разного GC-состава на матрице с "приведенными" концентрациями иммобилизованных олигонуклеотидов. Гибридизацию и отмывку проводили при 35 С.

Остаточная радиоактивность приведена в процентах к уровню радиоактивности фрагмента ДНК, взятого для гибридизации; на

45 фиг.7 — гибридизация (позиция а) и отмывка (позиция б, в) флуоресцентно меченных фрагментов ДНК на "гибридизационном чипе" (1,4 — те же дуплексы, что и на фиг,З, позиция б). Размер квадратика 0,1 х 0,1 мм, 50 г †.демонстрация чувствительности метода: ячейки 1, 2,и 3 содержат соответственно 1 фмоль, 100 амоль и 10 амоль тетраметилродаминоцого производного дезоксиуридина.

Пример 1. Возможность использования геля в качестве носителя в предлагае.мом способе и устройстве подтвер>кдается следующим примером.

Олигонуклеотиды были синтеэированы твердофазным фосфорамидитным методом (снятие защит проводили в насыщенном

1-;п4088 водном растворе аммиака при 55ОC в течение 12 ч) и очищены электрофорезом в ПААГ в денатурирующих условиях.

Олигануклеотиды метили Р((у P)ATP и полинуклеотидкинэзой Т4) по 5 -концу до специфической активности 3 мкКи/пмоль.

Из двух предметных с1екол, одно из которых обработано Bind Silane, а другое—

Repel Sllane (КВ) и покрыто тойким слоем

TritonX-100, собирали "сэндвич" как для заливки плоских полиакриламидных гелей с прокладкой толщиной 30 мкм, Сэндвич заполняли раствором 8 -ro акриламида, 30:1

N,N -метиленбисакриламида, персульфатэ аммония и ТЕМЕО (как для заливки ПААГ) и оставляли для полимеризации на 1 ч.

После полимеризэции верхнее стекло снимали. Стекло со слоем полиакриламида обрабатывали в течение часа при комнатной температуре 50%-ным гидразином, Для формирования матрицы часть геля удаляли.

Олигодезоксинуклеотиды, содержащие на

3 -конце З-метилилуридин, окисляли 1 MM периодатом натрия в течение 1 ч при комнатной температуре, осаждали 10 -ю объемами 2 /-го LiCi04 в ацетоне и растворяли в воде. На воздушно сухую матрицу для иммобилизации с помощью микроманипулятора, снабженного дозатором с капиллярной насадкой, наносили капли по 0,5 мкл окисленного олигонуклеотида (в концентрации 10 пмоль/мкл, если не оговорено особо), Пластинки помещали на 4 ч во влажную камеру, сушили 0.5 ч на открытом воздухе, промывали гибридизационным буфером (см. ниже), ополаскивали водой и хранили воздушно сухими при — 20 С. Тонкие гели достаточно прочны и удобны в работе, позволяют благодаря прозрачности определять интенсивность флуоресценции при помощи микроскопа. Судя по изображениям то,ек иммобилизованных олигонуклео-. тидов, гибридизованных с флуоресцентно мечеными фрагментами ДНК, олигонуклеотиды иммобилизуются в виде компактного пятна площадью около 1 мм, Как правило, олигонуклеотиды иммобилизовали в ячейках квадратной матрицы, которая в дальнейшем называется "олигонуклеотидной матрицей".

В качестве линкера выбран 3-метилуридин, присоединенный 5 -3 -меж нуклеотидной фосфодиэфирной связью к иммобилизуемому олигонуклеотиду. Выбор

3-метилуридина определялся тем, что он не образует прочных водородных связей ни с одним иэ природных оснований.

Окисление 3 -концевого рибонуклео.. зида олигонуклеотида 1 Nat04 приводит к производному 2 несущему на 3 -конце диэльдегидную группировку. С другой стороны, при обработке полиакрилэмидэ 3 гидразином часть эмидных.групп замещается нэ гидразидные 4, которые легко реагируют с

5 3 -диальдегидом. При этом образуется относительно стабильное морфолиновое производное 5 (фиг.2), Ход иммобилизации контролировали по (5 - Р) метке, введенной с помощью кина- . ! 32

10 зы в иммобилиэуемые олигонуклеотиды, Выход иммобилизации, т,е. доля олигонуклеотида, необратимо связавшегося с гелем, 80 При этом та же величина для неокисленного олигонуклеотида, использованного

15 в качестве контроля нэ неспецифическую сорбцию, составила менее 2 . Таким образом, доля молекул, связанных специфически за 3 -конец, превышала 98, Связь олигонуклеотида с полиакрила20 мидом устойчива, и матрица выдерживает не менее 5-7 циклов гибридизации/отмывки без заметного изменения гибридиэационных свойств, Время полураспада связи олигонуклеотид-гель при 60 С составляет 2

25 ч, а при 25 С вЂ” 36ч.

Емкость носителя оценивали путем иммобилизации одного и того же количества

32

P-меченого олигонуклеотида, разбавленного немеченым до различной специфиче30 ской активности. 100 пмоль холодного олигонуклеотида на точку (т.е. на 1 мм поверхности или 0,03 мм обьема геля) не наз сыщали связывания. Аналогичные эксперименты с окисленным периодатом

35 (а -P)UTP показали, что емкость геля составляет около 1 нмоль на 1 мм поверхности геля. Это соответствует концентрации

30 мМ активных групп (концентрация амидных групп в 8%-ном полиакриламиде со40 ставляет 1 М);

Пример 2, Гибридизация и дискриминация мисматчей в предлагаемом способе подтверждается следующим примером. . На подготовленной, как в примере 1, 45 олигонуклеотидной матрице была проведена гибридизация четырех гептадекануклеотндов — сиквенсового праймера фага М13:5

-d(GTAAAACACGCCAGT) и трех его производных, отличающихся одним основанием

50 (подчеркнуто):

5 -d(GTAAAACGATGGCCAGT)

5 -d(CTAAAACGAAGG CCAGT)

5 -d(GTAAAACGACG GG CCAGT) с иммобилизованными в геле олигонуклео55 тидами (длиной 7, 8, 9, 12 и 15 мономерных звеньев), полностью или частично комплементарными различным участкам гептадекамеров.

Меченный фрагмент ДНК (0,1 мкКи, 30 фмоль).в 1 мкл буфера гибридизации (1 M

1794088 число 7-, 8-, 9-, 12- и 15-членников, полностью или частично комплементарных прай- 45 меру М13. а также дуплексов, содержащих другие типы мисматчей. Данные по отмывке дуплексов гептадекадезоксинуклеотидов с иммобилизовэнными октадезоксинуклеотидами приведены в таблице.

Как видно из фиг.3 и таблицы, почти всегда существует такая температура, при которой отношение гибридизационных сигналов полностью комплементарного и соответствующего дефектного дуплекса достаточно велико (не гленее 10 раз), чтобы надежно различить их. Исключение составляют некоторые краевые мисматчи, стабильность которых аномально высока, Однако этот факт ни в коей мере не ОгрэниNaCI 10 мМ фосфат, рН 7,0, 1 мМ EDTA) наносили на матрицу с иммобилизованными олигонуклеотидами так, что каждая капля гибридизационной смеси в точности покрывает точку иммобилизованного олигонуклеотида и инкубировали 1 ч при 00С.

Пластинку ополаскивали буфером гибридизации при 0 С, затем отмывали 10 раз по 1 мин 20 мл того же буфера при температуре, повышающейся на 5 С на каждой ступени отмывки, После каждой ступени гибридизационный сигнал регистрировали через свинцовый коллиматор в каждой точке счетчиком радиоактивности (Minlmonitor 125, Victoreen, США), снабженным сумматором импульсов.

Отношение остаточной радиоактивности к исходной в данной точке откладывали на графике в логарифмическом масштабе в зависимости от температуры, Соответствующую сглаженную кривую мы будем называть в дальнейшем "кривой отмывки" дуплекса (фиг;3), В качестве меры стабильности дуплексов выбрэлй температуру отмывки (T ), которую определили как температуру, при которой гибридизационный сигнал в соответствующей точке уменьшается в 10 раз по отношению к исходному уровню. На фиг,З представлены кривые отмывки дуплексов, образованных праймером М13 или его atlaлогами с GC (фиг.З,а) и AT-богатыми (фиг.З,б) октэнуклеотидами, иммобилизованными B геле, комплементарными двум различным участкам праймера М13, но образующими дефектные дуплексы с его производными (все дуплексы представлены на фиг;3). В дальнейшем 17-членные дезоксиолигонуклеотиды в отличие от иммобилизованных олигонуклеотидов мы будем называть

"фрагментами ДНК".

Кроме олигонуклеотидов, показанных нэ фиг.3, было исследовано значительное

40 чивает применимость предлагаемого способа. Действительно, при исследовании известных последовательностей (например, выявление мутаций) всегда можно выбрать такой иммобилизуемый олигонуклеотид, чтобы ожидаемая замена оснований оказалась внутри дуплекса. С другой стороны, при анализе неизвестной нуклеотидной последовательности (сиквенс ДНК) проблема краевых мисматчей относительно легко решается при обработке на ЭВМ результатов гибридизации фрагмента ДНК с "полной" олигонуклеотидной матрицей. Способ обладает большой устойчивостью за счет избытка информации (в случае гибридизации с октануклеотидами мы получаем 7-кратный избыток информации, причем любой нуклеотид фрагмента ДНК в шести случаях из восьми образует внутреннюю пару с иммобилизованным олигонуклеотидом и лишь в двух случаях — краевую).

Таким образом, сравнение кривых отмывки позволяет различать полностью комплементарные и дефектные дуплексы и таким образом обнару>кивать одиночные замены оснований в ДНК.

Зависимость кривых отмывки дуплекса от обьемной концентрации иммобилизованного олигонуклеотида в геле, Как видно из фиг.4. Т дуплекса сильно зависит от количества олигонуклеотида, иммобилизованного в пятне данного размера. Для исследованного интервала концентраций в пределах экспериментальной ошибки температура отмывки дуплекса повышается на определенное число градусов при увеличении концентрации иммобилизованного олигонуклеотида в определенное число раз.

Данное правило выполняется для всех исследованных дуплексов (на фиг.4 приведен один из многочисленных примеров).

Это позволяет обнаруживать мисматчи в дуплексах разного GC-состава "на одной пластинке", Кэк видно из фиг.3, показанные там двэ иммобилизованных олигонуклеотида настолько различаются по GC-составу, что и ол н остью комплемента рн ы и дуплекс

AT-богатого олигонуклеотида (фиг.3,а, кривая 1) менее устойчив, чем дуплексы GC-богатого, содержащие мис латчи (фиг,36, кривые 2 и 3). Очевидно, что в такой ситуации гибридизация фрагмента ДНК с матрицей, на которой иммобилизованы оба олигон, ..леотида, при любой фиксированной темпе атуре не позволяет узнать с точНОСТЬЮ; О ОДНОГО ОСНОВЭНИЯ, И)ЛО10ТСЯ ЛИ В данном фрагменте комплеме lTl!:. Гп|е им последовательности или нет.

Сбнаруженнэя нами зависимость Т,; от концентрации им лобилизолэнно о Олиго1794088

5

45

55 нуклеотида позволяет решить проблему уравнивания температур диссоциации дуплексов различного GC-состава наиболее

l простым и изящным способом. Как показано на фиг.5, кривые отмывки AT- u GC-богатого дуплексов (Л Т, = 30 С при равных концентрациях) могут быль полностью совмещены путем подбора концентраций иммобилизованных олигонуклеотидов в соответствующих точках.

Можно совместить кривые отмывки для любого набора олигонуклеотидов и таким образом получить "приведенную" матрицу олигонуклеотидов. Температуры отмывки полностью комплементарных (совершенных) дуплексов для всех точек такой матрицы близки между собой, что позволяет с помощью всего одной отмывки при оптимальной температуре однозначно определить те точки матрицы, с которыми анализируемый фрагмент ДНК образовал совершенные дуплексы.

Дополнительное достоинство "приведенной" матрицы заключается в том, что все ее точки можно не только отмывать, но и гибридизовать при той же оптимальной температуре, что существенно упрощает процедуру анализа. Гибридизация и отмывка при одной и той >ке оптимальной температуре увеличивает разрешение метода.

Указанный принцип проиллюстрирован в модельном эксперименте (фиг.б). "Приведенную" матрицу олигонуклеотидов (по три точки ка>кдого из двух) гибридизовали и отмывали при 35 С. Соотношение остаточных сигналов однозначно показывает, в каких точках дуплексы были полностью комплементарными, несмотря на то, что один из мисматчей — краевой GT, весьма устойчив.

Пример 3. Повышение чувствительности, точности и воспроизводимости предлагаемого способа и устройства подтверждается следующим примером, Подготавливалась олигонуклеотидная матрица, как в примере 1, Для гибридизации были использованы фрагменты с флуоресцентной меткой тетраметилродамином-ТМР на 3 -конце. вводимой с помощью терминальной полинуклеотидтрансферазы, Сравнение соответствующих кривых отмывки показало, что

TMP не влияет на устойчивость дуплекса, Использование флуоресцентной метки позволило проводить гибридизацию в микромасштабе. На фиг.7 представлены микрофотографии фрагмента микроматрицы, на которой октануклеотид 5 -d(GGCCGTCG) иммобилизован в квадратиках геля со стороной 100 мкм. Такие микроматрицы мы будем называть "гибридизационными чипами". Как видно на фиг,7, позиция а, гибридизация с таким "чипом" позволяет весьма надежно детектировать замены отдельных оснований в последовательности (на фиг.7в квадратик 1 (правильный дуплекс) квадратики 2, 3 и 4 (дуплексы с мисматчами GA, GT u

СС, соответственно).

Поскольку распределение флуоресцентной метки может быть измерено с очень высокой чувствительностью и пространственным разрешением, например, при помощи микроскопа, то предел обнаружения гибридизационного сигнала определяется только отношением сигнал/фон и не зависит от размеров объекта, интенсивность флуоресценции которого измеряется. Следовательно, чувствительность обратно пропорциональна площади объекта, т.е. ячейки олигонуклеотидной матрицы в нашем случае. Действительно, миниатюризация матрицы позволила очень сильно повысить чувствительность способа. Так, квадратики, изображенные на фиг,7, позиция г, содержат соответственно 1 фмоль, 100 амоль и 10 амоль тетраметилродаминового производного дезоксиуридина. При этом отношение сигнал/фон для квадратика г 3 равно 2, что достаточно для надежного определения количества вещества.

Результаты модельных экспериментов, показывают принципиальную возможность анализа последовательности ДНК путем гибридизации со стандартным набором олигонуклеотидных проб, иммобилизованных на одной пластинке (матрице). Метод позволяет однозначно отличать правильные дуплексы от содержащих одну неправильную пару, Использование "приведенных" матриц делает практическую процедуру простой и удобной, Применение флуоресцентной метки существенно упрощает процесс считывания информации. Наконец миниатюризация олигонуклеотидной матрицы, а в настоящее время получены "чипы" с размером квадратиков геля 25 х 25 мкм, позволит не только экономить олигонуклеотидный материал, что само по себе очень важно, но и автоматизировать как процедуру гибридизации и отмывки, так и считывание и анализ информации.

Известно, что в мировой практике стоимость определения 1-ой пары нуклеотидов составляет 3-5 долларов. Основные преимущества предлагаемого способа (при соответствующей доработке известного аппаратурного обеспечения) по сравнению с мировыми аналогами заключается в более высокой производительности пр«более низкой стоимости за счет использования микраколичеств реагентов, а так же

1794088

15

20 вследствие снижения трудоемкости за счет возможности автоматизации всех процессов.

На известных мировых аналогах (к примеру, на модели секвинатора ТЕ2000 фирмы "Hoefer ScIentIfIc Instruments", США) цикл определения последовательности ДНК длиной 500 пар нуклеотидов составляет 22 ч. Из них 6 ч затрачивается непосредственно на секвенирование и 16 ч на радиоавтографию и расшифровку. Количества используемых реагентов измеряются в граммах.

Формула изобретения

1; Способ определения нуклеотидной последовательности ДНК, включающий нанесение на стеклянную подложку набора олигонуклеотидов, проведение гибридизации с меченной тестируемой ДНК, отмывку при температуре плавления дуплексов, определение одиночных замен оснований в тестируемой ДНК по анализу распределения метки, отличающийся тем, что, с целью повышения достоверности способа, упрощения определения известных точечных мутаций в нуклеотидной последовательности, на стеклянной .подложке

Другие известные аналоги обеспечивают примерно такую же производительность, Отличие состоит лишь в объеме сервиса, представляемого пользователю.

5 Предлагаемый способ и устройство могут обеспечить производительность в 400 раз большую при одновременном сокращении рутинного труда пользователя. При этом количества основных реагентов изме10 ряется в микрограммах.

Важно отметить, что в предлагаемом способе в основном используется не радиоактивная, а флуоресцентная метка. предварительно формируют матрицу из геля-носителя, а гибридизацию и отмывку проводят при одинаковой температуре.

2. Устройство для определения нуклеотидной последовательности 4НК, включающее стеклянную подложку и матрицу, о т л ич а ю щ е е с я тем, что, с целью повышения достоверности определения нуклеотидной последовательности, матрица представляет собой одинаковые участки геля толщиной

10-30 мкм и наибольшей длиной 25 — 100 мкм с расстоянием между участками, равным удвоенной наибольшей длине.

Тепловая диссоциация совершенных дуплексов и дуплексов, содержащих одиночные мисматчи

Мисматч СС

;gqf, c) CTGGCCGT

3 †-TGACCGGCAG(36+0,5) *Данные усреднены по трем измерениям.

* Понижение температуры отмывки дефектного дуплекса по сравнению с совершенным, П р и м е ч а н и с, Мисматчи выделены жирным шрифтом, М -.матрица, символ d для удобства опущен.

Правильный дуплекс (т, с) Гм

OTCGTTTT

У вЂ” - GCAG CAAAAT(28 +0,5) lM

CGTCGTTT

У вЂ” -GGCAGCAAAA(28 +0,5) Гм

CCGTCGTT

3 - -CGGCAGCAAA(33 +0,5) 0CC0TCGТ

3 - -CCGGCAGCAA(41 Ю,5) Гм

QOCCGTCG

3 — -ACCGGCAGCA(50 Ю,5) ГМ

TGGCCGTC

3 — -GACCGGCAGC(41Ю,5) ГМ

ACTGGCCG

3 TGACCOGCA(39+ 1) Мисматч GT (hT*, С) Гм тсотттт

3 — - G AG CAAAATт (-7 +.1) Гм

С TCGTTT

3 — -GG AGCAAAAT (-13 «+2) Гм

СС TCGTT

3 — -CGG AGCAAAT (-12+1) Осс тсоФ

3 — -CCGG AGCAAT (-11 й1,5}

О rM

GGCC TCG

3 - -ACCGG AGCAT (-14 1,S) Гм

TGOCC ТС

3 - -GACCGG AGCT (-12+0,5) Гм

CTGGCC Т

3 - - TGACCGG AGT (-10«+1,5) ACTGGCC

У-TGACCGG АТ (-5 1) Мисматч GA

{лт,**, с>

IM

ТСОТТТТ

У вЂ” -О AGCAAAATA (-16+2) ГМ

С TCGTTT

У вЂ” -GG AGCAAAA-.

A (-21+ 1) ССОТСОТФ

У вЂ” -CGG AGCAAAA (-24+1) GCC ТСОТ

3 - -CCGG AGCAAA (-25й1) IM

GGCC TCG

3 †-ACCGG AGCAA (-23+ 1) TOGcc т(3 - -GACCGG AGC»

А (-17Щ5) ОГ

CTGGCC Т

3 --TGACCOG АОА (-6+1) ACTGGCC

3 -TGACCGG АА (-2«0,5) СОТСОТТФ

3 - -G CAOCAAAAС (-3+0,5) IM

С GTCGTT

3 - -CG САОСААА

С (-30+1) ОС ОТСОФ

3 - -ССО САОСАА-.

С (-36+2) С Г

GGC GTCG

3 --ACCG CAGCAC (-33+1) TOGCCGTA

3 - -GACCG CAGCC (-37+ ) с Г

CTGOC ОТ

У--TGACCG CAGC (-35+0,5) ACTGGC О

3 -TGACCG САС (-30+0,5) П П

О-Р 0

0-Р=О

P-0

Ь г

H0Q ОНО

N8I04

H NH

2,4

HO ОН п и г ,G П П

1794088

П П П П

П П П П

П П П П о

HQ N OH

1791088

Я 100

U

10 (D

С:

О 1

Д„) 0 10 20 30 40 50

:Л ") 1 0

О 1

С3 0 10 20 30 40 50

Темпepamypa отмыбки, С гм

GTCGTTTT

3 -ТОАСССОСАОСААААТО

10 20 30 40

ТЕМПЕРСГПУРа ОГПМЫЬК1.1, С

О

У (С

E 1 о 0

I hr

ОТ((ГГГГГ

I: 3 -ТОЛСС(ОСЛ(ГСЛЛЛЛТ(l

Ihf

G 1СО Г1TÃ

2: 3 -TGACCGGTAG(AAAÀ Го гл

CTCGTTTT

3: 3 -TGACCGGA AGCAAAA ТС гм

ОСССОТСО

1: 3 -TGACCGGCAGCАААЛТО

ООССОТСО

2 3 ТОАССООТАОС А ААА1 G

ГЛ4

GGCCGTCG

3: 3 -ТОАСССОААОС А AAATG м:

GGCCGTCO

4 3 ТСАССО(.САОСАAAATG

1794088

I - 5 пмоль

3 - 0,3 пмоль

2 — 5 пмоль

4 - 90 пмоль

Фиг. 5 отсотттт-Л4

3 -TGACCGOCAGCAAAATO

GTCGTTTT Л4

3 -ТОАССООАAGCAAAATG

ОТСОТТТТ-М

3 -TGACCGGTAOCAAAATG

GGCCGTCG II4

3 -ТОАССООСАОСААААТО

GGccGTcG л

3 -ТОАССООААОСААAATG

1GO

20 40 60 8О

Остабыоеая Оу лексь, ж

З о х

< с

10 а

О 1

0 10 20 30 40 50

Температура отмыбкц, С

ООССОТСО

3 -ТОАССООТАОСААААТО гл

GGCCGTCO иЗ: 3 -TGACCGOCAGCAАЛАТО

)М отсотттт

2и4: 3 -TGACCGGCAOCAAAATG

1794088

Составитель К. Храпко

Редактор А, Савина Техред М. Моргентал Корректор,М, Ткач

Заказ 524 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101