Штамм рекомбинатного вируса осповакцины v 7,5 с - продуцент корового антигено вируса гепатита в
СОЮЗ СОВЕТСКИХ
СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ
РЕСПУБЛИК
ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ
ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4928632/13 (22) 17,04.91 (46) 15.01.93. Бюл. N 2 (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт молекулярной биологии Научнопроизводственного обьединения "Вектор" (72) И.П,Дмитриев, П.Ю.Муратов и А.С.Беляев (56) Авторское свидетельство СССР
М 1651555, кл, С 12 К 15/00, 1989. (54) ШТАММ РЕКОМБИНАНТНОГО ВИРУСА ОСПОВАКЦИНЫ V7,5С - ПРОДУЦЕНТ
КОРОВОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА В
Изобретение относится к медицине и биотехнологии, конкретно к генетической инженерии и представляет собой штамм рекомбинантного вируса осповакцины, предназначенный для разработки живой или субьединичной вакцины против гепатита В, Целью изобретения является конструирование штамма рекомбинантного вируса осповакцины, экспрессирующего С-ген (HB Сущность изобретения заключается в toM, что, используя плаэмидную ДНК р7,5С, получают рекомбинантный вакцинный штамм вируса осповакцины (ВОВ) ч7,5С, содержащий НВ,-ген под контролем 7,5к промотора в составе тк-гена ВОВ, охарактеризованного методами дот- и блот-гибридизации, рестрикционного анализа и, экспрессирующего HBcAg, что оценивается „„5U „„1788012 А1 (я)з С 12 К 15/51, С 07 К 15/00; С 12 N 15/86 (57) Использование; в биотехнологии и генетической инженерии, для получения живой вакцины против гепатита Ц, Сущность изобретения: рекомбинантный вирус осповакцины получен на основе плазмидной ДНК р7,5С, состоящей из фрагмента генома вируса гепатита В, содержащего С-ген без АТГ-кодона, большей части рге С-области, и вектора pVAR15, обеспечивающего интеграцию и экспрессию С-гена в составе гена тимидинкиназы ВОВ ЛИВП. Штамм н7,5С экспрессирует НВ Ад, индуцирующий развитие гуморального и клеточного иммунного ответа у животных. 3 табл. по наличию корового белка в лизатах клеток CV-1, инфицированных рекомбинантом v7,5Ñ, а также по развитию гуморального и клеточного иммунного ответа на кроликах и мышах. Штамм характеризуется следующими признаками, Морфологические признаки. Штамм v7,5Ñ обладает свойствами типичного представителя семейства ортопоксвирусов, Вирионы штамма имеют размер 200х300 нм, характерную брикетообраэную форму и по данным электронной микроскопии не отличаются от исходного штамма ЛИВП. Физиолого-биохимическая характеристика и культуральные свойства штамма, ДНК ш1амма ч7,5С имеет длину около l80 т.п.о„при этом вместо Hind! И вЂ” К-фрагмента штамма ЛИВП (аналогичного Hlflcl lll - фрагменту штамма МЙ) имеется фрагмент большего молекулярного веса (5700 п.о.), no 1788012 20 55 данным ДНК-ДНК блот-гибридизации содержащий НВС-ген вируса гепатита В. При размножении v7,5С на развивающихся куриных эмбрионах характер поражений на хориоаллантоисных оболочках такой же, как и при размножении исходного штамма ЛИВП. Кроме того, штамм v7,5С не отличается по продуктивности в монослое перевиваемых линий клеток CV-1, Rat-2, а также в монослое фибробластов эмбрионов кур. В отличие от штамма ЛИВП рекомбинант ч7,5С обладает tk-фенотипом, не способен к размножению на перевиваемой линии клеток Rat-2 в присутствии 25 мкг/мл бромдезоксиуридина. Патогенность для животных. Исследование свойств штамма v7,5С на лабораторных животных показало, что в стандартных тестах на токсичность, безвредность, некротическую активность, специфичность, рекомбинантный штамм ч7,5С не отличается от исходного штамма ЛИВП. Иммуно-биологические свойства штамма ч7,5С. Штамм ч75С высокоиммуногенен, он вызывает гуморальный иммунный ответанти-НВС - и анти - ВОВ-антитела при иммунизации кроликов в дозе 2х10 ООЕ/животное. Антитела определяют методом иммуно-ферментного анализа. Помимо индукции специфического антителообразования, иммунизация штаммом ч7,5С вызывает и ярко выраженный клеточный ответ на HB Основным отличием штамма ч75С от ЛИВП является способность .к синтезу НВсАц при инфицировании культуры клеток CV-1, Индикацию экспрессии осуществляют с помощью метода иммуно-ферментного анализа. Штамм описанного рекомбинанта ч7,5C (pVAR 15/Sty 1/HB AMH СССР за номером ГКВ М 2208 от 15.11.89 г, Изобретение иллюстрируется следующими примерами: Пример 1. Получение рекомбинантного вируса осповакцины, экспрессирующего НВС-ген вируса гепатита В и анализ уровня экспрессии HB Кубарики с монослоем перевиваемой линии клеток почек зеленой мартышки линии CV-1 заражают вирусом осповакцины штамма ЛИВП с множественностью 0,050,1 БОЕ/кл. Адсорбцию проводят при 370С 1 ч, затем удаляют неадсорбированный вирус и клетки покрывают поддерживающей средой (Игла ДМЕМ с 2% эмбриональной сыворотки), Через 1 ч инкубации при 37 С поддерживающую среду сливают и на клетки наносят по 0,5 мл/кубарик кальций-преципитата ДНК рекомбинантной плазмиды (р7,5С) и ДНК вируса осповакцины ЛИВП и инкубируют при комнатной температуре 45 мин. Затем клетки покрывают 4,5 мл среды Игла ДМЕМ с 8% эмбриональной сыворотки и инкубируют при 37 С 3,5 ч. После этого среду заменяют на свежую с 8% эмбриональной сыворотки и клетки инкубируют еще 18-24 ч. Урожай вируса после трансфекции замораживают, оттаивают и раститровывают на ТК Rat-2 клетках в присутствии 25 мкг/мл бромдезоксиуридина под агаровым покрытием. Через 48 часов инкубации наносят второе покрытие с 0,002% красителя нейтрального красного, Вирусы, полученные из отдельных бляшек, подращивают в 24-луночных пластиковых платах (флунки = =16 мм) и анализируют методом ДНК-ДНК дот-гибридизации на наличие чужеродной ДНК. Положительные по гибридизации клоны дважды клонируют и анализируют экспрессию генов вируса гепатита В s составе ДНК рекомбинантных вирусов осповакцины. С этой целью монослой CV-1 в 24-луночных платах (лунки = 16 мм) инфицируют рекомбинантным вирусом осповакцины со множественностью 20 БОЕ/кл, проводят адсорбцию вируса при 37 С 1 ч, после чего удаляют неадсорбированный вирус, монослой промывают средой Игла ДМЕМ, после чего в каждую лунку добавляют по 1 мл среды Игла ДМЕМ с 2% эмбриональной сыворотки. Зараженные клетки инкубируют 24 ч при 37 С в присутствии 5% С02, Культуральную жидкость отбирают в пробирки и тестируют экспрессию HBcAg вируса гепатита В. Оставшиеся клетки заливают 1 MR среды Игла ДУЕМ, двухкратно замораживают и оттаивают, отрабатывают ультразвуком дважды по 10 сек. Полученные таким образом лизаты клеток тестируют на экспрессию НВ,Ag твердофазным иммуноферментным методом, Было обнаружено, что в лунках клеток через 48 ч после замораживания содержится HB Пример 2, Характеристика иммунобиологических свойств рекомбинантного штамма v7,5С. 1788012 Индукцию специфического антителообразования (анти-Н Вс-антител) изучают, сравнивая иммунизацию кроликов вирусным рекомбинантом ч7,5С в сравнении с иммунизацией ВОВ штамма ЛИВП вирусным методом накожной скарификации в дозе 2х10 БОЕ/животное, Взятие крови проводят до иммунизации и через 2, 3, 4, 6 и 11 недель после нее. Анализ полученных сывороток на наличие антител против HBcAg проводят прямым и конкурентным иммуноферментным методами. Для этого HBcAg сорбируют в лунках 96-луночного планшета, затем добавляют разведения сывороток и инкубируют в течение 18 часов при 20 С. После инкубации лунки промывают и проявляют связавшиеся антитела коньюгатом белка А с пероксидазой хрена с последующей окраской ортофенилендиамином. Интенсивность окраски измеряют по поглощению света при длине волны 405 нм, Титр антител определяют по максимальному разведению сыворотки, дающему двухкратное превышение оптической плотности по сравнению с чистой сывороткой (до иммунизации). В табл. 1 приведены данные по определению анти-HBcAg прямым иммуноферментным методом. В табл,1 приведены средние данные трех определений, ошибка во всех случаях не превышает + 5 для L = 0,95. Как видно из полученных данных, только у одного кролика из четырех, иммунизированных вирусом н7,5С, а также у кролика, инфицированного вирусом осповакцины (LИВП), не было обнаружено антител против HBcAg. Остальные 3 кролика индуцируют гуморальный иммунный ответ на введение HBcAg вируса гепатита В, Причем у первого кролика анти-Н В,-антитела определяются со второй недели по шестую в титре 1;900, а у третьего и четвертого кроликов титры антител достигают 1:2700, 1;8100 и сохраняются в течение 11 недель, Полученные данные подтверждаются конкурентным иммуноферментным методом в тест-системе на анти-НВ -антитела производства фирмы "l à Roche" (Франция). В этом случае сыворотки иммунизированных кроликов исследуют на способность подавлять связывание анти-НВ,А9-lgG, меченных пероксидазой хрена, с сорбированным HBcAg. Наличие анти-НВ -антител в тестируемых сыворотках определяют по уменьшению оптической плотности в пробах(А=405) ниже0,73. Пробы с А=405 выше 0,73 считаются отрицательными и, соответственно, не содержат антитела против НВсА9 вируса гепатита В. Результаты по выявлению анти-НВ -антител конкуретным методом представлены в табл,2. В табл.2 приведены средние данные трех определений, ошибка во всех случаях не превышает +.5 для L =-0,95. Как видно из табл.2, данные, полученные конкурентным иммуноферментным методом, полностью подтверждают результаты исследования сывороток иммунизированных кроликов прямым иммуноферментным методом. Для оценки уровня клеточного ответа мышей линии BALB/c, рекомендованной ВОЗ для испытания иммуногенности вакцин против гепатита В, с массой 8 — 10 г иммунизируют вирусной суспензией рекомбинанта ч7,5С и ВОВ штамма ЛИВП в корень хвоста в дозе 4,0 10 ООЕ/мышь, Спленоциты, получаемые из селезенки, выделяют на 9-е сутки после иммунизации для постановки РБТЛ. Уровень клеточного иммунного ответа оценивают по коэффициентам РБТЛ, определяемых по отношению среднего количества импlмин с антигеном и без него. Для этого стерильно извлеченные селезенки, измельчают в стеклянном гомогенизаторе, трижды отмывают в питательной среде, и, определив количество спленоцитов в камере Горяева, разводят с тем расчетом, чтобы в каждую лунку 96-луночной планшеты попадало 10 спленоцитов, Культивируют в СО -инкубаторе с 5 СОг при 37 С в течение 4-5 сут в среде РРМ1-1640 с добавлением 1-глутамина (300 мкг/мл), гентамицина (160 мкг/мл), 2-меркаптоэтанола (5 10 М) и 10 эмбриональной бычьей сыворотки. В лунки также добавляют митогены: неспецифический-кон канавалин А (по 2,5 и 25 мкг на лунку), и специфические — ВОВ штамм ЛИВП в натрий-фосфатном буфере (a концентрации 25 мкг на лунку) и HBcAg (по 0,1:1 и 10 мкг на лунку). Результаты оценивают по включению Н -тимидина, добавленного за 18 ч до оконз чания культивирования в дозе 1 мкКи на лунку. Контролем служат лунки, не содержащие митоген. После инкубации с Н -тимидином клетз ки осаждают на фильтры GFF, промывают 5 -ным раствором трихлоруксусной кислоты и раствором зтанола, Фильтры с фиксированными на них мечеными клетками просушивают и помещают во флаконы со сцинтилляционной жидкостью (0,5 2,5-дифенилоксазол (РРО) и 0,03 1,4-lis-2-(5-фенилоксазолил-бензен (РОРОР) в толуле) для Таблица 1 Определение антител к HB;Ag вируса гепатита В прямым иммуноферментным методом р у р ру Обозначения: "-" — отсутствие анти-НВ,Ад; "н.о." — не определялось. регистрации включения Н -тимидина на Р.з счетчике. Результат оценивают, рассчитывая коэффициент усиления или ингибирования включения Н -тимидина в пробах с внесенз ным митогеном и без него (контролем по их отношению, Результаты представлены в табл.3). Представлены коэффициенты бласттрансформации лимфоцитов. Ошибка не превышает 10% для L= ОЯ5. Как видно из табл,3 рекомбинантный штамм вируса осповакцины v7,5С инфицирует образование клонов, сенсибилизированных к H B Ag лимфоцитов, что указывает на наличие выраженного специфического клеточного иммунного ответа на НВ,Ао у животных, иммунизированных рекомбинантом v7,5С, по сравнению с контрольными жи воти ы ми (интактн ыми и иммунизированнымими ВОВ штамм ЛИВП). Пример 3, Характер1лстика патогенных и некоторых биологических свойств штамма м7,5С. При подкожном введении вирусной сусггензии рекомбинантного штамма ВОВ v7,5С множественностью 5 1 О OOE/ìûøü в стерильном физиологическом растворе в объеме О,? Мл не отмечается никаких патологи еских изменений в течение 5 дней наблюдения после введения, что свидетельствует о безвредности штамма (наблюдались 2 группы беспородных мышей по 10 >ки вотн ых каждая). На скарифицированной коже кроликов штамм v7,5Ñ образует типичные вакцинальные оспины на 5-7-е сутки, что свидетельствует о специфичности штамма. Тест проеодят на трех белокожих кроликах массой 2,53,5 кг, На скарифицированных участках кожи кроликов площадью 5 см2 наносят и 5 тщательно втирают соответственно по 0,1 мл вирусной суспензии в дозах 10з, 10, 105 (00E/мл). Через 5-7 сут хотя бы на одном из зараженных участков кожи должны образоваться типичные вакцинальные оспины, что 1 0 и наблюдалось, Для проверки некротической активно сти штамма ч7,5С, вирусну,о суспензию вводят внутрикожно на скарифицированные участки кожи кроликов (используется 2 жи15 вотных) в двух местах в дозе 10 00E/0,1 мл; л на 4-5-е сутки некрозов в месте введения не наблюдается, следовательно рекомби I;Il!T v7,5С не обладает некротирующей активностью, КзучеHíblе свойства не отличаются от 20 тактовых исходного штамма ВОВ ЛИБП. Таким образом, впервые получен штамм рекомбинантного вируса осповакцины, обеспечивающий экспрессию С-гена вируса гепатита В в клетках млекопитающих, 25 Применение рекомбинантного штамма v7,5Ñ представляется перспективным в сочетанли с другим штаммом рекомбинантного ВОВ в 7,5S -S, экспрессирующим preS2 и НВ.;Ао, оказавшимся весьма эффективным, 30 Такое комбинирование могло бы приьести к значительному усилению иммунного эффекта вакцинации против гепатита Б. Формула изобретения 35 Штамм рекомбинантного вируса осповакцлны v7,5С ГКВ-2208 — продуцент корового антигена вируса гепатлта В. 1788012 Таблица 2 Определение антител против НВ,Ag конкурентным иммуноферментным методом начения; "н.о. — не определялось, Таблица 3 Индукция клеточного ответа сенсибилизированными спленоцитами мышей, иммунизированных ч7,5С и ВОВ штамм ЛИВП Составитель Т.Онищенко Техред M.Ìîðãåíòàë Корректор Н.Ревская Редактор Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул.Гагарина, 101 Заказ 49 Тираж Подписное ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5
