Способ получения биологически активного комплекса

 

Использование: в медицине в качестве протеолитически активного агента. Сущность изобретения: в качестве высокомолекулярного соединения при получении биологически активного комплекса используют соль сополимера винилпирролидона с кротоновой кислотой и основания диметилбензилалкиламмония, а взаимодействие террилитина с высокомолекулярным соединением проводят при pH среды 6,0 - 8,0 и массовом соотношении общего количества террилитина и соли сополимера, равном 1 : 8 - 1 : 12, при удельной протеолитической активности террилитина не менее 25 ПЕ/мг белка. 1 табл.

Изобретение относится к химии высокомолекулярных соединений, а именно к получению полимерных соединений, обладающих биологической активностью, которые могут найти применение в медицине. В медицинской практике, например, при лечении ран, ожогов, гнойных и воспалительных заболеваний необходимо проводить лечение препаратами, обладающими одновременно антимикробным и протеолитическим действием. По источникам научно-технической информации и патентной документации не выявлены способы получения таких препаратов. Известен способ получения водорастворимых физиологически активных полимерных солей путем взаимодействия сополимеров винилпирролидона и непредельных кислот с четвертичными аммониевыми основаниями. Полученная полимерная соль обеспечивает широкий спектр противомикробного действия. Известны ферменты микробного происхождения, обладающие протеолитическим действием, которые могут быть использованы в медицине. В лечебной практике используются водные растворы этих ферментов, например террилитин, при этом специфическая активность его в таких условиях сохраняется очень непродолжительное время. Специфическая активность раствора нативного террилитина при хранении в холодильнике сохраняется в течение 0,5-1 мес. Целью изобретения является увеличение стабильности протеолитической активности целевого продукта. Поставленная цель достигается в способе получения биологически активного комплекса, включающем взаимодействие при комнатной температуре в водном растворе террилитина с высокомолекулярным соединением, тем, что в качестве высокомолекулярного соединения используют соль сопо- лимеров винилпирролидона с кротоновой кислотой и основания диметилбензилалкиламмония, а взаимодействие террилитина с высокомолекулярным соединением проводят при рН среды 6,0-8,0 и массовом соотношении общего количества террилитина и соли сополимера, равном 1: 8-1: 12, при удельной протеолитической активности террилитина не менее 25 ПЕ/мг белка. Условия образования биологически активного комплекса определяются природой фермента, его концентрацией, а также такими параметрами реакционной среды, как рН, присутствием неорганических солей и т.д. Образование биологически активного комплекса по изобретению происходит в результате электростатического взаимодействия между противоположно заряженными функциональными группами фермента и полимерной соли, т.е. с одной стороны происходит усиление гидрофобных взаимодействий внутри глобулы белка, приводящее к стабилизации нативной структуры, с другой стороны создаваемое гибкоцепным многозарядным полимером микроокружение препятствует агрегации молекул фермента, тем самым предотвращая явление автолиза, приводящее к потере активности. Одновременно антисептические свойства полимерной соли предотвращают бактериальное заражение раствора, содержащего фермент. Биологически активный комплекс по изобретению сохраняет протеолитическую активность длительное время (12 месяцев) находясь в водном растворе, в отличие от известных комплексов (см. таблицу). П р и м е р 1. 250 мл раствора полимерной соли сополимера винилпирролидона с кротоновой кислотой и основания диметилбензилалкиламмония с концентрацией полимерной соли 16 мг/мл в 0,1 М растворе NaCl смешивают с 250 мл рабочего раствора террилитина. Рабочий раствор террилитина готовят из водного концентрата террилитина концентрации 2,9 мг белка/мл с активностью 80 ПЕ/мл, сливая 175 мл концентрата террилитина с 75 мл дистиллированной воды. При этом в реакционной смеси общим объемом 500 мл реализуются условия взаимодействия по концентрации реагирующих компонентов: полимерной соли 8 мг/мл, террилитин 1 мг белка/мл, следовательно, массовое соотношение террилитин (по белку): полимерная соль равно 1:8 при удельной активности фермента 25 ПЕ/мг белка. Полученную реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре в течение 15-20 мин при рН 6,0. При отклонении значения рН от заявляемого интервала, которое может произойти в результате взаимодействия компонентов, реакционную смесь подтитровывают 2-3 каплями концентрированного раствора едкого натра или соляной кислоты соответственно. Процесс ведут при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке. Биологически активный комплекс выделяют лиофильно. Полученный биологически активный комплекс хорошо растворим в воде, обладает высокой протеолитической активностью и антимикробными свойствами, эффективен в отношении штаммов микроорганизмов, устойчивых к действию антибиотиков. Выход по протеолитической активности составляет 90% П р и м е р 2. Как в примере 1,250 мл раствора полимерной соли концентрации 24 мг/мл в 0,1 М растворе NaCl смешивают с 250 мл рабочего раствора террилитина, полученного из концентрата фермента, содержащего 2,9 мг белка/мл с активностью 100 ПЕ/мл, рН реакционной среды 8,0. При этом реализуются следующие условия получения биологически активного комплекса массовое соотношение фермент (по белку) полимерная соль 1:12, удельная активность террилитина 35 ПЕ/мг белка. Лиофильно высушенный целевой продукт биологически активный комплекс имеет выход по протеолитической активности 96% Весь белок в комплексе связан с полимерной солью. П р и м е р 3. Как в примере 1,250 мл раствора полимерной соли концентрации 10 мг/мл в 0,1 М растворе NaCl смешивают с 250 мл рабочего раствора фермента, полученного из концентрата террилитина с концентрацией 2,9 мг белка/мл и активностью 100 ПЕ/мл. При этом реализуются следующие условия: массовое соотношение фермент (по белку) полимерная соль 1:5, удельная активность террилитина 35 ПЕ/мг белка. Протеолитическая активность лиофильно высушенного комплекса составляет 95% от исходной. Результат гель-хроматографии показал, что только небольшая часть активного белка (15%) связана в высокомолекулярный комплекс. При этом полученный препарат не проявляет необходимое антимикробное действие. Тест на обсемененность препарата показал наличие микрофлоры до 1000 КОЕ/мл. П р и м е р 4. Как в примере 1, 250 мл раствора полимерной соли концентрации 40 мг/мл в 0,1 м растворе NaCl смешивают с 250 мл рабочего раствора фермента, полученного из концентрата террилитина, содержащего 2,9 мг белка/мг с активностью 100 ПЕ/мл при рН среды 7,0. При этом реализуются следующие условия массовое соотношение фермент (по белку): полимерная соль 1:20, удельная активность 35 ПЕ/мг белка. Протеолитическая активность высушенного комплекса составляет 50% от исходной. П р и м е р 5. Получение биологически активного комплекса проводят, как описано в примере 1 за исключением того, что раствор полимерной соли берут в концентрации 20 мг/мл, а взаимодействие происходит в 0,05 М фосфатном буфере, рН 5,0. При этом реализуются следующие условия: массовое соотношение фермент (по белку): полимерная соль 1:10 при удельной активности террилитина 25 ПЕ/мг белка. Протеолитическая активность лиофильно высушенного комплекса составляет 30% от исходной активности фермента. П р и м е р 6. Получение биологически активного комплекса проводят, как описано в примере 2, за исключением того, что взаимодействие террилитина с полимерной солью происходит в 0,1 М содовом буферном растворе, рН 9,0. При этом реализуются условия массовое соотношение фермент (по белку): полимерная соль 1: 12, удельная активность террилитина 35 ПЕ/мг белка. В этих условиях происходит образование высокомолекулярного комплекса с протеолитической активностью 25% от исходной активности фермента. П р и м е р 7. Биологически активный комплекс получают аналогично описанному способу по примеру 1. Берется 250 мл раствора полимерной соли концентрации 24 мг/мл в 0,1 М растворе NaCl и смешивается с 250 мл рабочего раствора фермента, полученного из концентратора террилитина, содержащего 2,9 мг белка/мг с активностью 45 ПЕ/мл, рН среды 7,0. При этом реализуются следующие условия получения биологически активного комплекса: массовое соотношение фермент (по белку): полимерная соль 1:12, удельная активность террилитина 15 ПЕ/мг белка. Протеолитическая активность высушенного лиофильно комплекса составляет 95% от исходной активности фермента или 1,0 ПЕ/мг, что недостаточно для создания лечебного действия. П р и м е р 8. Биологически активный комплекс получают аналогично описанному способу по примеру 1. Берут 250 мл раствора полимерной соли концентрации 20 мг/мл в 0,1 М растворе NaCl, смешивают с 250 мл рабочего раствора террилитина, содержащего 2 мг белка/мл с активностью 90 ПЕ/мл. Рабочий раствор террилитина готовят, растворяя 500 мг высокоочищенного лиофильно высушенного фермента в 250 мл дистиллированной воды. При этом реализуются следующие условия взаимодействия по концентрации реагирующих компонентов: полимерной соли 10 мг/мл, террилитина 1 мг белка/мл, следовательно, массовое соотношение террилитин (по белку): полимерная соль 1:10 при удельной активности фермента 45 ПЕ/мг белка. При проведении реакции взаимодействия наблюдается потеря активности фермента. Протеолитическая активность высушенного комплекса составляет 30% от исходной.

Формула изобретения

Способ получения биологически активного комплекса, включающий взаимодействие при комнатной температуре в водном растворе террилитина с высокомолекулярным соединением, отличающийся тем, что, с целью увеличения стабильности протеолитической активности комплекса, в качестве высокомолекулярного соединения используют соль сополимера винилпирролидина с кротоновой кислотой и основания диметилбензилалкиламмония, а взаимодействие террилитина с высокомолекулярным соединением проводят при pH среды 6,0 8,0 и массовом соотношении общего количества террилитина и соли сополимера, равном 1 8 1 12, при удельной протеолитической активности террилитина не менее 25 ПЕ/мг белка.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2