Штамм бактерий bacillus licheniformis - продуцент термостабильных амилолитических ферментов

 

Использование: биотехнология различные отрасли народного хозяйства в ряде производств, где применяются амилолитические ферменты, а именно в спиртовом, крахмало-паточном, пивоваренном, текстильном производствах где требуются ферменты , устойчивые к повышенным температурам. Сущность изобретения: штамм бактерий Bacillus lichenrformis ВКПМ В-2986 выделен из естественной почвенной ассоциации, продуцирует в определенных условиях не менее трех термостабильных амилолитических ферментов, активных при диапазоне значений рН 5,0 - 10,0, активен при 30 - 100° С с максимальной активностью ферментов в культуральной жидкости при 90 - 95° С термостабилен при 90°С в водных растворах рН 6,0 - 8,5 в течение 40 мин. Активность а-амилазы 1,78 ед/мл/мин. пуллуланазы 0,68 ед/мл/мин, а-глюкозидазы 3.49 ед/мл/мин. 4 табл.

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Ь)

CO

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 5021951/13 (22) 11.11.91 (46) 15.10.93 бюл. Мя 37-38 (71) Институт микробиологии и вирусологии имДКЗаболотного АН УССР (72) Павлова И.Н„Кичакова НА; Жопнер Л.Г„Захарова ИЯ„Тиньянова Н.З. (73) Институт микробиологии и вирусологии имДКЗаболотного АН УССР (54) ШТАММ БАКТЕРИЙ (BACILLUS

LICHENIF0RMIS) — ПРОДУЦЕНТ ТЕРМОСТАБИЛЬНЫХ АМИЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ (57) Использование: биотехнология различные отрасли народного хозяйства в ряде производств, где применяются амилолитические ферменты, а именно (19) RU (11) 2001103 С1 (51) 5 C12N9 26 C 12N1 20 в спиртовом, крахмало-паточном, пивоваренном, текстильном производствах где требуются ферменты, устойчивые к повышенным температурам.

Сущность изобретения: штамм бактерий Bacillus

licheniformis ВКПМ В-2986 выделен из естественной почвенной ассоциации, продуцирует в определенных условиях не менее трех термостабильных амилолитических ферментов, активных при диапазоне значений рН 5,0 — 10,0, активен при 30—

100 С с максимальной активностью ферментов в купьтурапьной жидкости при 90 — 95 С термостабилен при 90 С в водных растворах рН 60 — 8,5 в течение 40 мин. Активность a — амипазы 1,78 ед/мл/мин, пулпупаназы 0,68 ед/мл/мин, а-гпюкозидазы 3,49 ед/мл/мин. 4 табл.

2001103

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к производству амилолитических ферментов при помощи микробиологического синтеза.

Амилолитические ферменты находят широкое применение в различных областях народного хозяйства и используются в больших количествах для разжижения и/или превращения крахмала и крахмалосодержащего растительного сырья в такие продукты, как и мальтодекстрины, сахарные сиропы, декстроэу, мальтоэу и глюкозу. Особенности технологических процессов в ряде производств, где применяются амилолитические ферменты, а именно в спиртовом, крахмало-паточном, пивоваренном, текстильном производствах, требуют использования ферментных препаратов, устойчивых к повышенным температурам.

При ферментативной конверсии крахмала в глюкозу, мальтоэу, фруктоэу для целей пищевой промышленности обычно требуется несколько ферментов: альфа- и бета-амилаза, гидролиэующие альфа-1,4-глюкозидные связи с образованием мальтоэы и олигомальтодекстринов; глюкоамилаза, расщепляющая альфа-1,4- и, с меньшей скоростью. альфа-1,6-глюкозидные связи с образованием глюкозы; альфа-1,4-глюкоэидаза (мальтаза), разрывающая альфа-1,4-связь в молекуле мальтозы, Глубокий гидролиз крахмала также необходим в спиртовой крахмало-паточной и текстильной промышленности. Для достижения этой цели обычно используют вначале альфа-амилазу (при температуре 70-80 С и рН 6,0 — 6,5), затем раствор охлаждают, подкисляют и добавляют другой фермент— глюкоамилазу или бета-амилазу. При этом в молекуле крахмала часть глюкоэидных связей (альфа-1,6-связи) остаются недоступными действию этих ферментов.

Непродуктивные энергетические затраты (при снижении температуры гидролизуемого материала), а также значительное увеличение концентрации ионов (при изменении

pH). затрудняющие очистку конечного продукта, представляют собой существенные недостатки такого процесса амилолиза. Избежать этих двух недостатков можно при использовании комплексов амилолитических ферментов различной специфичности (естественных или созданных искусственно), работающих в одинаковых физико-химических условиях. Для более полной конверсии сырья весьма важно, чтобы в таких препаратах содержался также фермент, способный к гидролиэу альфа-1.6-глюкозидных связей в молекуле крахмала и мальтоолигодекстринов, а именно один из деветвящих ферментов (пуллуланаза или изоамилаза), При промышленном использовании амилолитических ферментов необходимы ферменты термостабильные, так как проведение процесса раэваривания и гидролиза крахмала в режиме 80 — 100 С является предпочтительным, а также полезным с точки зрения уменьшения времени реакции и сни10 жения опасности микробного загрязнения.

Для подавляющего большинства продуцентов амилолитических ферментов характерен предпочтительный биосинтез одного из ферментов. Способность к образованию комплекса внеклеточных амилолитических ферментов, особенно термостабильных, обнаруживается очень редко. В этой связи можно назвать ряд термофильных анаэробов из рода Clostrldlum. Так, штамм CI.

20 thermonydrosulfurlcum. Другой синтезирует термостабильную пуллуланазу и глюкоамилазу (1), Несколько анаэробных термофилов иэ рода Clostridlum осуществляет биосинтез амилаэы и пуллуланаэы (2,3), либо альфа-амилазы и глюкоамилаэы активных при высокой температуре (4).

Наиболее близким к заявляемому является штамм Clostrldlum

thermohydrosulfurlcum E 101 — 69 (5), образующий комплекс амилолитических ферментов при росте на полусинтетической среде следующего состава, г/л; крахмал 20; дрожжевой экстракт 5; триптон 10; мясной экстракт 3; KHzP04 6,8; KzHP04 ЗН20 11,4;

FeS04 7 Н20 0,1; CaClz 2 Н20 0,1; BDH 0,001.

Комплекс содержит альфа-амилазу, поллуланазу и альфа-глюкоэидазу, при совместном действии которых амилоза и пуллулан расщепляются до глюкозы.

40 Недостатком способа получения препарата амилолитических ферментов из термофильного клостридия является прежде всего то, что для использования в СССР этот штамм недоступен. Сложности культивиро45 вания анаэробов в заводских условиях делают этот микроорганизм практически непригодным в качестве промышленного продуцента.

Устранение этих недостатков и упрощение способа получения термостабильных амилолитических ферментов достигается путем использования отечественного продуцента — аэробной споровой палочки иэ рода Bacillus вид В.llchenlformls, предпоч55 тительно ВКПМ В-2986.

Заявляемый штамм Bacillus

llchenlformls БКПМ В-2986 продуцирует в определенных условиях не менее трех термостабильных амилолитических ферментов, активных при одних и тех же значениях рН

2001103

55 активных при одних и тех же значениях рН и температуры, что позволяет рассматривать этот штамм как продуцент ферментов, составляющих естественный комплекс, перспективный для одновременной обработки крахмала или крахмалосодержащего сырья с целью его глубокого гидролиза.

Штамм ВКПМ В-2986 выделен из естественной почвенной ассоциации, воздействию мутагенных факторов не подвергался.

Микроорганизм непатогенен, а культуральная жидкость, полученная при глубинном культивировании штамма. нетоксична, Морфология: микроорганизм, предлагаемый в качестве продуцента термостабильных амилолитических ферментов, имеет вид одиночных палочек размером О, х 2,0 — 3,0 мк, редко встречаются короткие цепочки; клетки подвижные, окраска по Грамму положительная; у 23 — 24-часу роста в жидких средах появляются споры, имеющие центральное положение и овальную форму, При росте на агаризованных органических средах штамм дает обильный рост, колонии непрозрачные, шероховатые, врастают в агар.

Старая агаровая культура имеет коричневатый оттенок.

При культивировании в мясо-пептонном бульоне наблюдается обильный рост клеток, раствор становится мутным, к 16-18-часу роста появляется красновато-коричневый оттенок, Выращивание культуры на агаризованных средах, содержащих казеин или микробные клетки, сопровождается обильным ростом и образованием зон гидролиза вокруг колоний.

Культуральные и биохимические свойства: штамм ВКПМ В-2986 растет при 18—

36 С (температурный оптимум 45 С) при значениях рН среды 5,0 — 9,5 (оптимальное значение рН 6,5 — 7,5) в аэробных условиях.

Микроорганизм способен расти на средах, содержащих 7 Д NaCI.

Культура предлагаемого микроорганизма сбраживает с образованием кислоты арабинозу, ксилоэу, фруктозу. сахарозу, трегалоэу, мальтоэу, раффинозу маннозу, маннит, сорбит, глицерин, декстрин, гликоген без выделения газа, глюкозу ферментирует анаэробно; восстанавливает нитраты до нитритов, образует тироэинаэу, каталазоположительный, образует сероводород, утилизирует лимонную кислоту, восстанавливает лакмусовое молоко, разжижает желатин, вызывает гемолиэ, быстро гидролизует казеин и крахмал. Штамм способен расти на средах с аммонийными солями в качестве единственного источника азота, а также на среде, содержащей в качестве источника углеродного и азотного питания дрожжевые клетки (прессованные

45 пекарские дрожжи или БВК), На основании указанных свойств в соответствии с определителем Берги штамм идентифицирован как

Bacillus Ilcheniformis, Штамм хранится в течение 19 лет при

4 С на косяках с агаризованной средой следующего состава, г/n: сухие пекарские дрожжи 20; КН2Р04 2; MgS04 7 HzO 1; вода водопроводная до 1 л. Пересев культуры осуществляется не реже одного раза в два месяца.

Энгимология: штамм В,llchenlformls

ВКПМ В-2986 при росте на среде иэвестного состава синтезирует широкий набор внеклеточных ферментов, в том числе амилолитические. Для роста культуры и биосинтеза амилолитических ферментов источником углерода могут служить крахмал, гидролизованный крахмал, мальтоза, кукурузная и другая зерновая мука или их экстракты, дрожжевые клетки. Источником азота служат гептон, дрожжевой экстракт, мясной экстракт, дрожжевые клетки, мочевина, аммонийный азот, Синтезированные штаммом амилолитические ферменты проявляют альфа-амилазную, пуллуланазную и альфа-глюкоэидазную активности. гидролизуя разветвленные и линейные альфа-глюканы.

Комплекс амилолитических ферментов характеризуется следующими свойствами: способен гидролизовать крахмал, растворимый крахмал, амилопектин, гликоген, пуллулан, амилозу, а также расщеплять синтетический хромогенный субстрат-и-нитрофенил-альфа-D-глюкопиранозид; благодаря наличию деветвящей активности (пуллуланазной) осуществляет разрыв не только альфа-1,4-, но и альфа-1,6-глюкозидных связей в молекуле крахмала и декстринов с образованием количества глюкозы и низкîMîëåêóëÿрныx мальтоолигосахаридов; активен в диапазоне значений рН 5,010,0 с двумя заметными пиками активности (при рН 6,0 и рН 8,5); активен при 30-100 С с максимальной активностью ферментов в виде культуральной жидкости при 90 — 95 С; термостабилен, а именно способен сохранять без изменений активность при 90 С в водных растворах (рН 6 Π— 8 5) в течение 40 мин, в присутствии ионов кальция (0,001 М) 2 ч; при температуре 100 С в присутствии ионов кальция (0,01 М) активность не меняется в течение 20 мин.

Таким образом, штамм ВКПМ В-2986 осуществляет биосинтез термостабильных

2001103 щглочестойких амилолитических ферментов, активных в одних и тех же физико-химических условиях, что позволяет рекомендовать этот штамм в качестве продуцента ферментов. составляющих естественный амилолитический комплекс.

Способ получения термостабильных амилолитических ферментов с помощью заявляемого штамма состоит из двух стадий.

Стадия 1. Выращивание инокулюма.

Получение посевного материала (инокулюма) осуществляли на жидкой питательной среде следующего состава, г/л, сухие пекарские дрожжи 20; КН2Р04 2; MgS04 7 Н20 1; вода водопроводная до 1 л. Среду стерилизовали в течение 20 мин при 0,75 атм, Материал для засева колб получали путем смыва культуры В.lichenlformls ВКПМ В-2986, хранящейся на скошенной агаризоланной среде того же состава, как указано ранее.

Культивирование проводили в колбах объемом 500 мл, содержащих 50 мл стерильной среды, на качалке (220 об/мин) при 45 С в течение 18-20 ч, Стадия 2. Биосинтез амилолитических ферментов. В 0,5-литровые колбы, содержащие определенный объем среды известного состава, вносили инокулюм в количестве 35% к объему среды и вели культивирование на качалке (220 об/мин) при определенной температуре в течение 72 — 168 ч. Начиная с

24 ч роста культуры каждые 24 ч отбирали пробы и определяли в культуральной жидкости способность гидролизовать крахмал, амилопектин, амилозу, гликоген, пуллулан и пара-ыи,зофенил-альфа-О-глюкопираноз ид (ПНФ ), т.е. активность ряда ферментов превращения крахмала, Активность культуральной жидкости или ее фильтрата по отношению к естественным субстратам определяли по увеличению количества редуцирующих сахаров (стандарт — глюкоза) в инкубационной смеси, содержащей исследуемый материал (0,1 мл), субстрат (0,1 мл 1 -ного раствора) и

0,05 М Трис-HCI-буфер рН 8,5 до общего объема 2 мл. Реакцию проводили в течение

10 мин при 90 С. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое обусловливало образование 1 мкмол глюкозы в условиях опыта за 1 мин.

Редуцирующие сахара определяли по методу Нельсона-Шомоди.

Активность альфа-глюкозидаэы (мальтазы) определяли по способности гидролиэовать хромоге нный субстрат пара-нитрофенил-альфа-D-глюкопираноз ид в реакционной смеси, содержащей О, 1 мл исследуемого материала. 0,1 Мп 0,1 -ного раствора с1 бстрата и 0,1 мл 0,05 М Трис5

HCI-буфера рН 8,5. Реакцию останавливали, приливая 2 мл 1 M Ма2СОэ. За единицу активности принимали такое количество фермента, которое обусловливало образование одного мкмол пара-нитрофенола эа 1 мин в условиях опыта. О количестве отщепленного пара-нитрофенола судили по интенсивности развившейся окраски, учитываемой при

410 нм.

Использование заявляемого штамма

В.licheniformis ВКПМ В-2986 в качестве продуцента комплекса термостабильных амилолитических ферментов может быть проиллюстрирован следующими примерами.

Пример 1. Выращивание инокулюма осуществляли по способу. описанному ранее. Для биосинтеза амилолитических ферментов штаммом ВКПМ В-2986 в качестве ферментационной испольэовали среду следующего состава, г/л: крахмал растворимый

40; сухие пекарские дрожжи 30; КН2Р04 4;

Mg S04 7 Н20 2; CaS04 2,5; вода водопроводная до 1 л, Среду стерилизовали 20 мин при

0,5 атм. Простерилиэованную среду засевали инокулюмом в количестве 5% к ее объему и инкубировали в течение 120 ч при 42 С на качалке. Каждые 24 ч определяли активность амилолитических ферментов в культуральной жидкости. Полученные данные представлены в табл. 1.

Пример 2. Выращивание инокулюма осуществляли по способу, описанному ранее. В качестве ферментационной использовали среду следующего состава, г/л: кукурузная мука 120; кукурузный экстракт

20; (NH4)ISO 3; мочевина 4,5; мел 5; рН

7,2-7,4. Среду обрабатывали коммерческим препаратом альфа-амилаза (0,5 ед/г крахмала, исходя иэ того, что в муке содержится

72% крахмала) при 50ОC в течение 1 ч, а затем среду стерилизовали обычным способом.

Стерильную среду засевали 5% инокулюма и инкубировали на качалке в 0,5-литровых колбах, содержащих 50 мл среды, при

42 в течение 7 сут, отбирая пробы для определения активности каждые 24 ч (начиная с 48 ч роста). Результаты представлены в табл. 2.

Пример 3, Выращивание инокулюма проводили в жидкой среде, как указано ранее. Ферментационные колбы объемом 0,5 л содержали по 0,1 л среды следующего состава, г/л: крахмал растворимый 40; сухие пекарские дрожжи 20; КН2Р04 2; MgS04>

7Н20 1: CaS04 5; вода водопроводная до 1 л. Простерилиэованную среду засевали инокулюмом в количестве 3% к ее объему и инкубировали в течение 96 ч при 28, 37, 42, 1О

2001103

Таблица 1

Динамика амилолитической активности штамма В.llchenlformis ВКПМ В-2986 в условиях примера 1

46 и 54 С на качалке, Через каждые 24 ч отбирали пробы и определяли активность ферментов превращения крахмала в фильтрате культуральной жидкости. Максимальные значения амилолитической активности культуры, выращиваемой при различной температуре, представлены в табл. 3.

Таким образом, заявляемый штамм

В,lichenifoirmis ВКПМ В-2986 при культивировании на питательных средах известного состава осуществляет биосинтез не менее 3 аминолитических ферментов, проявляющих альфа-амилазную, пуллуланаэную и альфаглюкоэидазную активности при одних и тех же значениях рН и температуры и демонстрирующих высокую термостабильность.

При этом альфа-амилазная и альфа-глюкоэидазная активности заявляемого штамма были заметно выше таковых прототипа— штамма Clostridium thermohydrosulfuricum

Е 101 — 39 (9), В табл. 4 приведены сравнительные данные по амилолитической активности (максимальные значения) заявляемого штамма и штамма — прототипа при глубинном культивировании в оптимальных

5 для каждого из них условиях, Заявляемый штамм в большей степени пригоден для промышленного использования, нежели штамм-прототип, так как он культивируется в аэробных условиях и на

10 среде простого состава. (56) 1.Appl, Environ. Mlcroblol.— 1985.-49.—

P. 11 68-1173.

2. Agr.Biol. Chem.— 1976.-40,-P. 151515 1522.

3. Appl. Microblol. Blotechnol.— 1987.27P. 192 — 1988.

4. Патент Великобритании Q 2145094, кл. С 12 N 9/34, 1985.

20 5, J,Gen. Mlcroblol. 1987, 133, р. 883890.

2001103

Таблица 2

Таблица 3

Влияние температуры выращивания на амилолитическую активность штамма

В,llchenlformis ВКПМ В-2986

Таблица 4

Сравнение активности ферментов превращения крахмала штаммов В.ilchenlformls ВКПМ

В-2986 и Cl.thermohydrosulfuricum Е 101-39

Динамика амилолитической активности штамма B,llcheniformls ВКПМ В-2986 в условиях примера 2

2001103

Продолжение табл, 4

Ф о P MYë а и зоб рете н ия 5 Штамм бактерий Bacillus llchenlformls штАММ БАктеРий BAclLLUs LlcHENIFoRMls - цКПМ ц-298б-продуцент термостабильных

ПРОДУЦЕНТ ТЕРМОСТАБИЛЬНЫХ ЛМИЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ амилолитических ермент в, Составитель И. Привалова

Техред М.Моргентал Корректор Н, Ревская

Редактор

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Заказ 3112

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

П р и м е ч а н и е. " " — единицы активности прототипа (9) приведены в соответствие с использованными в настоящей разработке (мкмол глюкозы в мин на мл культуральной жидкости);

" — мальтаэная активность прототипа (9) выражена через активность по ПНШГ в соответствии с единицами, указанными в каталоге фирмы "Sigma" "Blochemlcals Organic

Compounds..." 1991, P.639, М, 3145,