Штамм бактерий alcaligenes eutrophus - продуцент над- зависимой гидрогеназы

 

(1 ) (1) (11) то (2 ( ( (7 (7 (5 (6

ЮЗ СОВЕТСКИХ

ЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПЯ ЛИК

СУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

Омство ссср тгоспАтент cccp) АВТОРСКОМУ СВИДЕ ПЛЬСТВУ

) аы7бЗ/1З

) 27.0990

) 30.12.93 Бюл Ив 48-47

) Институт микробиологии AH СССР

) Савельева НД; Жилина Т.Н„ Заварзин CA

) ШТАММ БАКТЕРИЙ ALCAUGENES

R0PHUS — ПРОДУЦЕНТ НАД-ЗАВИСИЙ ГИДРОГЕНАЗЫ

Изобретение относится к микробиологической мышленности, в частности к получению ферменмикробного происхождения. Сущность изобре2 тения: штамм Alcatigenes entrophus ИНМИ-101 получен длитаъной селекцией исходного штамма 4

eutrorhus Z — f, является продуцентом активной

НАД-зависимой гидрогеназы, фермента, катапизирующего реакцию восстановления НАД в присутствии водорода Удельная активность до 17 мк моль

НАДН/мин/мг белка в грубых экстрактах . Препараты НАД-.зависимой гидрогеназы могут быть использованы в биотехнологии благодаря ее уникальным каталитическим свойствам, доступности и широкой субстратной специфичности.

1839186

Изобретение относится к микробиологической промышленности, в частности к получению ферментов микробного происхождения, а именно к получению НАД-зависимых гидрогеназ.

Известен штамм Alcallgenes eutrophus

Z-1, являющийся продуцентом НАД-зависимой гидрогеназы. Активность фермента составляет 8 — 9 мкмоль НАДН/минlмг белка (2). Недостатком данного штамма является невысокая активность фермента—

НАД-зависимой гидрогеназы, Целью изобретения является штамм-активный продуцент НАД-зависимой гидрогенаяы.

Указанная цель достигается аэробной факультативной хемолитоавтотрофной мезофильной водородокисляющей бактерией

Alcaligenes eutrophus ИНМИ Z-101, депони-" рованной в коллекции Центрального музея промышленных микроорганизмов ВНИИгенетики под номером В-3354.

Предлагаемый штамм получен путем длительной селекции исходного штамма А.

eutrophus Z-1 в условиях хемолитоавтотрофного роста (культивирование на жидкой минеральной среде в атмосфере газовой смеси из водорода, кислорода и углекислого газа). Культивирование проводят в стациойарных условиях или путем ферментаций, осуществляемых в периодическом или проточном режиме, с удалением отработанного газа и без удаления его. В результате проведенной селекции предлагаемый штамм А.

eutrophus изменил свой потенциал используемых органических субстратов и существенно повысил активность ключевого фермента метаболизма водорода: НАД-зависимой гидрогеназы. Удельная активность

НАД-зависимой гидрогеназы этого организма составляет 17 мкмоль НАДН/мин/мг белка в грубых экстрактах клеток.

Культурально-мо алогические и изнаки: клетки штамма А. eutrophus Z-101 представляют собой средней величины грамотрицательные палочки 0,35-0,5х2 5 мкм, часто в коротких цепочках. В молодых культурах клетки имеют 1-2 жгутика, у более старых культур отмечается перетрихиальный тип жгутикования. Размножаются клетки делением пополам, слизи не образуют.

На агариэованных экстрактивных средах организм образует серовато-белые плоские со слегка приподнятым центром и лопастным краем колонии. На агаризованной минеральной среде колонии округлые, блестящие, непигментированные. В хемолитаавтотрофных условиях, т. е. в атмосфере газовой смеси из 75";ь Нр, 15 (, 02 и 10ф, СО2 нв жидкой минеральной среде. рост

45 диффузный. Организм лучше растет при перемешивании жидкой среды, чем в стационарных условиях. Суспензия клеток молочно-белая, в старых культурах ксричневато-розовая. Оптимальная температура роста 28-30 С.

Физиолого-биохимические признаки: тивным хемолитоавтотрофом, т. е. способен расти как за счет азробного окисления водорода, используя углекислоту в качестве едик ственного источника углерода, так и органотрофно, используя разнообразные органические соединения. Сахара не сбраживает. На среде с нитратом возможна анаэробная денитрификация. Нитрат восстанавливает с накоплением нитрита. Гидролитическими ферментами не обладает; желатину не разжижает, крахмал не гидролизует. Углеводы сначала не использовались, но в процессе лабораторного культивирования появилась способность расти на фруктозе, а также был получен мутант, растущий на глюкозе. Однако, арабиноза, галактоза, ксилоза, лактоза, манноза, рибоза, сахароза и другие из проверенных углеводов оставались недоступными для данной культуры. Лучше всего используются органические кислоты и аминокислоты, спирты не используются совсем. Организм может расти на ароматических соединениях, включая фенол, бензоат, тестостерон, мета- и параоксибензойную кислоты. При проверке на чувствительность к антибиотикам было установлено, что часть из них, например тетрациклин или карбенциллин, ингибируют развитие организма, другие (такие как ампицилин, бензилпенициллин, гентамицин; рифампицин, стрептомицин) на него не действуют. В качестве источника азота используют аммоний, нитрат, нитрит, аминокислоты, амины, мочевину, целый ряд азотистых оснований.

Лабораторные исследования, проводимые в течение ряда лет с А. eutrophus Z-101, показали, что для сохранения высокой гидрогеназной активности у этого организма его необходимо поддерживать в условиях автотрофного роста, хранение организма в гетеротрофных условиях (пассажи на экстрактивных средах или средах с другими органическими субстратами) неминуемо приводит к резкому снижению активности

НАД-зависимой гидрогеназы.

Штамм Aicailgenes eutrophus Z — 101 для получения иэ него НАД-зависимой гидрогеназы выращивают на минеральной среде

Шлегеля следующего состава. г!л:

Мэ2НР04 12Н2О 4,5; K Нг РО 0,75, 1839186

ИНЕС! 2,0; MgSO4 0,20; CaClg 0,02, Fe{NH4)CsHgOz 0,012; МаНСОз 0,5. Вода дистиллированная 1000 мл, рН среды 6,9-7,1.

В срезу добавляются микроэлементы в количестве 2 мл/л. Смесь микроэлементов Хо- 5 агланда на 200 мл Н20 содержит, мг: НзВОз

22,8; СоС!2 6Н20 8,0; CuSO< 5H20 0,8;

MnClz 7Н20 0,8: Ег SO4 7Н20 1,76:

Ма2Мо04 2Н20 5,0; й! С!2 0,8. Газовая фаза состоит из 75-80 Н2, 10-15 02 и 10 10

COz. В факторах роста культура не нуждается. Оптимальная для роста температура 28130 с.

Периодический способ культивирования является наиболее приемлемым для 15 получения автотрофной биомассы А.

eutrophus — продуцента НАД-зависимой гидрогеназы. Причем максимум активности этого фермента приходится на конец линей ной фазы роста предлагаемого организма. 20

Следующим этапом подготовки культу ры А. eutrophus для получения из нее активной НАД-зависимой гидрогеназы является наращивание организма по способу, описанному для бактерии — прототипа (2), где в 25 качестве субстрата и источника углерода используют цитрат натрия в концентрации

0,2-0,3 мол.%», а также глицерин в концентрации 0,2-0,3 об,, вводимый в питательную среду в начале стационарной фазы 30 роста. Вместо цитрата Na можно использовать также и фруктозу в концентрации 0,20,3 мол. ь, которая является более дорогим сырьем, но применение ее способствует получению фермента с более высокой 35 удельной активностью.

Наращивание биомассы А. eutrophus на, среде с цитратом и глицерином осуществля ют или на качалке в 2-. литровых колбах, наполовину заполненных средой, или в фер- 40 гментерах FL Blotec и АК вЂ” 3 — 1.

Определение НАД-зависимой гидрогена-. эы производят спектрофотометрически на ,Яресогб M — 40 при длине волны 340 нм. Мож но определять при температуре 25 и 37ОС. 45

Удельная активность гидрогеназы, вы,целяемой из А. eutrophus 2 — 101, возрастает po мере роста культуры. Максимальная дельная активность фермента отмечается в конце линейной фазы роста. При переходе 50 ультуры на стационарную фазу удельная активность снижается на 50 от макси мальной, также значительно более низкой является она в начальной фазе автотрофно(о роста культуры. 55

П р и M е р 1. Культуру выращивают ввтотрофно в ферментере с рабочим объемом 3 л (загрузка 100 :34 — жидкая среда, 66$ — газовое питание), Используют минеральную среду следующего состава, г/л:йа2НРОа 12Н20 . 4,5; КН2Р04 0,75;

NHpCl 2,0: MgS04 7Н20 0,20; СаО 0,02;

Fe-аммиачное лимоннокислое 0,012;

МаНСОз 0,50. Вода дистиллированная t000 мл, рН среды 7,0.

В среду добавляют микроэлементы Хоагланда в количестве 2 мл/л, Газовое питание для культуры подают из баллонов через систему редукторов. Используется газовая смесь состава: Hz 0, 02 10 СО2 10 . Скорость продувки этой смесью составляет 500 мл/мин. Скорость перемешивания 350 об/мин. Ферментация идет при температуре 28 С. В конце фазы линейного роста продувку культуры прекращают и еще сутки ее выдерживают в условиях недостаточного газового питания. Затем значительную часть культуры сливают, а оставшуюся часть (примерно 2-3 об.g) используют в качестве инокулята для ферментации того же организма на среде с цитратом натрия (цитрат дается по фону минеральной среды в количестве 2 г/л). Культивирование проводят в том же ферментере в периодических условиях при аэрации. В начале стационарной фазы роста, когда источник углерода — цитрат-ион — в среде исчерпывается (через 28 ч), в среду дббавляют

0,2 об. глицерина и продолжают- культивирование еще 36 ч, По окончании культивирования клетки осаждают на центрифуге при

5000 об/мин. Активность НАД-зависимой гидрогеназы определяют спектрофотометрически по скорости образования НАДН.

Удельная активность гидрогеназы в грубых экстрактах клеток составляет в этом случае

17 мкмоль НАДН/мин/мг белка.

Пример 2. Культуру выращивают в автотрофных условиях согласно примеру 1 до конца.фазы линейного роста. В отличие от примера 1 продувку газовой смесью из

80 H2, 10% О2 и 10 С02 не прекращают весь период роста культуры. Для инокулирования среды с цитратом натрия берут автотрофную культуру, находящуюся в стационарной фазе роста(через 42 ч с начала культивирования). Далее культивиоование проводится снова согласно примеру 1.

По окончании роста культуры на среде с цитратом и глицерином определяется активность НАД-зависимой гидрогеназы описанным выше способом. В этих условиях удельная активность фермента составляет

13 мкмоль НАДН/мин/мг белка.

НАД-зависимая гидрогеназа из

Alcallgenes eutrophus представляет собой сложный олигомерный палифункциональный фермент, играющий важнейшую роль в

1839186 (56)1. Авторское свидетельство СССР (Ф 1125245, кл. С 12 N 9/02, 1984.

2.Авторское свидетельство СССР

N. 1336569, кл. С 12 N 9/04, 1987.

Формула изобретения ВКПМ В-3354 - продуцент НАД - зависиШтамм бактерйй А!саИцепез eutrophus .мой гидрогеназы.

Составитель Т.Калинина

Техред М.Моргентал Корректор П. Гереши

Редактор M.Ñòðåïüíèêîâà

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035. Москва, Ж-35, Раушская маб., 4/5

Заказ 3403

Пр чз (щс анно и 4!)-!г. !1и !. 1! gÐ!Ф1:f!Qг П )тент", г. Уж оргщ, уд (л(метаболиэме этого водородокисляющего организма. Физиологическая роль этого фермента заключается в обеспечении клетки универсальным восстановительным эквивалентом — НАДН. 5

Использование данного штамма позволяет получать в 2 раза, более активную НАДзависимую гидрогеназу.

НАД-зависимая гидрогеназа является перспективным продуктом для ряда обла- 10 стей биотехнологии. Ферменты этой группы способны заменить существующие в настоящее время катализаторы на основе благородных металлов и рассматриваются, 15 например, как ключевые биокатализаторы в системах биоконверсии, тонком органическом синтезе, а также процессах, реализующих реакции изотопного обмена.

Преимуществом использования НАД-зависимой гидрогеназы является отсутствие побочных продуктов в катализируемой реакции, что существенно упрощает проблему очистки целевого продукта,