Способ отбора селекционных форм кукурузы с повышенной биологической ценностью

 

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИ

К ПАТЕНТУ

Комитет Российской Федерации по патентам и товарным знакам (21) 5006732/13 (22) 08.07.91 (46) 15.1 2.93 Бюп Na 45-46 (75) Феденко В.С.; Глушко ВВ. (73) Феденко Владимир Савельевич (54) СПОСОБ ОТБОРА СЕЛЕКЦИОННЫХ

ФОРМ КУКУРУЗЫ С ПОВЫШЕННОЙ БИОЛОГИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТЬЮ (в) ЮУ (11) 2004144 Cl (51.) 5 А 01 Н 1 04 (57) Использование: биотехнология, селекция, биохимическая генетика, растениеводство. Сущность изобретения: селекционные формы кукурузы с повышенной биологической ценностью отбирают при их идентификации по превышению величины оптической плотности белкового экстракта размолотого зерна исследуемых образцов над данным показателем контроля. 5 табл.

2004144

Изобретение относится к t>vloTBxHofloruu и сельскому хозяйству, в частности к генетическим исследованиям зерновых культур, и может быть использовано в селекционной практике для отбора хозяйственно ценных форм кукурузы с улучшенным качеством зерна.

Улучшение биохимического состава зерна кукурузы путем селекционно-генетических приемов с использованием эндоспермовых мутаций приводит к повышению сбалансированности белкового комплекса и содержания лимитирующих аминокислот.

Вместе стем улучшение биологической ценности зерна в мутантах сопровождается снижением урожайности, твердости зерна и устойчивости к заболеваниям, что ограничивает широкое использование в практике. В связи с, этим практическую значимость получили селекционные формы с модифицированным типом эндосперма на основе опейковой

\ мутации, в которых устраняются указанные отрицательные признаки наряду с сохранением повышенной питательной ценности. Учитывая сходные фенотипические проявления модифицированных форм с обычными аналогами возникает необходимость в разработке способов отбора, основанных на использовании биохимических маркеров качества зерна, Известные способы отбора включают выделение белковых фракций зерна, различающихся по растворимости, количественное определение белка в полученных препаратах методом Кьельдаля или с использованиемм индофенольного и биуретового реагентов. Согласно другому способу выделяют зеиновую и незеиновую фракции белков с

-.оличественным определением по г":язываwe с красителем. Отбор форм с улучшенным качеством зерна проводят по возрастанию доли полноценных белков и сни>кению количества спирторастворимого белка в суммарном белковом комплексе зерна.

К основным недостаткам указанных способов следует отнести длительность процедуры экстракции белковых фракций с использованием не менее четырех различных экстрагентов, необходимость количественного определения белка.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ, включающий выделение белкового экстракта в щелочной среде и проведение отбора по величине оптической плотности раствора после обработки аналитическим реагентом.

Согласно способу навеску размолотого зерна трижды экстрагируют раствором бората натрия (рН 10), содержащего додецилсульфат натрия и 2-мерка 1тоэтанол, в течение 60 мин. К суммарному экстракту прибавляют этанол до конечной концентрации 70, инкубируют в течение 30 мин, центрифугируют и отделяют супернатант, представляющий собой суммарную зеиновую фракцию. В полученном экстракте иммунохимическим методом определяют содержание

a â€,P — и р -зеинов по величине оптической плотности при 410 нм. Отбор форм кукурузы с повышенной биологической

10 ценностью проводят по возрастанию количества у-зеина или снижению содержания

a — и P — зеинов.

Основными недостатками указанного способа является необходимость количественной экстракции белка, проведение имму-. нохимического определения количества трех зеиновых фракций с применением дефицитных реагентов и материалов. При этом в результате длительного и сложного анализа процесс селекционной диагностики устанавливает контрастные различия для модифицированной опаковой кукурузы и не дает возмо>кность дифференцировать опаковые формы от обычных аналогов по уровню у-зеина, что снижает достоверность отбора.

Целью предлагаемого изобретения является упрощение и ускорение способа.

Способ осушествляется следующим образом.

Равные навески размолотого зерна исходной и исследуемой форм кукурузы экстрагиру от 0,01-0,5 M раствором щелочи, Экстракт отделяют фильтрованием и измеряют оптическую плотность полученного раствора при 350 нм на спектрофотометре, Отбор форм кукурузы с повышенной биологической ценностью проводят по возрастанию оптической плотности в 1,3 — 2,1 раза в сравнении с обычными аналогами. Значение аналитической длины волны {350 нм) определено экспериментально и соответствует максимуму поглощения экстракта, В качестве форм кукурузы с повышенной биологической ценностью использованы эндоспермовые мутанты типа о2/о2, о2/о2

su2/su2 с установленными биохимическими характеристиками и синтетики на основе мутантного гена опейк-2.

Отличительной особенностью способа

50 является использование в качестве маркерного признака для отбора величины оптической плотности в максимуме поглощения щелочного экстракта зерна.

По указанным отличительным признакам был проведен патентный поиск. Аналогичных решений не обнаружено, поэтому указанные признаки являются существенными.

Пример 1. Равные навески(по 50 мг) размолотого зерна исходной (А 204 -+/+) и

2004144

Продолжение табл. 1

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

2004144.Таблица 1 исследуемой (А 204 о2/о2) форм кукурузы постоянно встряхивают с равными обьема-. ми (по 5 мл) растворов едкого кали различной малярной концентрации (0,05-0,5 М), при комнатной температуре в течение 5 5 мин, фильтруют и измеряют оптическую плотность белковых экстрактов при 350 нм на спектрофотометре Спекорд M — 40 в 0,5 см кювете. Для оценки контрастности различий рассчитывают отношение измерен- 10 ных величин исследуемой и исходной форм.

Результаты определения оптических плотностей экстрактов, полученных при различных концентрациях растворов едкого кали, приведены в табл. 1 (данные статиче- 15 ски достоверны, ошибка измерений не более 5%).

Аналогично анализируют образцы размолотого зерна исследуемых и исходных форм кукурузы с использованием растворов 20 различной концентрации едкого натра (табл. 2), Полученные результаты показывают, что оптимальной концентрацией щелочи, обеспечивающей контрастность различий 35 — 71%, 25 является интервал 0,01-0,5 М. При использо- вании растворов с концентрацией ниже 0,01

M различия незначительны (10%), а возрастание концентрации выше 0,5 М значительно удлиняет время фильтрации суспензии, 30

Пример 2. Аналогично примеру 1 проводят отбор кукурузы с повышенной биологической ценностью (Nf 155 о2/о2, А 619 о2/о2) в сравнении с обычными аналогами с использованием 0,1 М раствора едкого 35 кали (табл, 3).

Пример 3. Определяют значения сравнительного показателя аналогично примеру 1 (концентрация едкого кали — 0,1

М) для двойных эндоспермовых мутантов 40 типа о2/su2 на основе различных обычных аналогов (табл, 4). В качестве показателя контрольного образца используют усредненное значение Оз5о=0,68 для исходных линий А204, ЧЧ155, Л 619 (примеры 1, 2).

Пример 4. Аналогично примеру 1 проводят определение оптической плотности белковых экстрактов зерна гетерогенного селекционного материала (0,1 M раствор едкого кали). В данном случае были использованы семьи третьего года самоопыления (Яз), которые получены во ВНИИ кукурузы из

16 линейных синтетиков кукурузы, содержащих в своем генотипе мутантный ген опейк2 (табл, 5). В качестве показателя исходной формы используют усредненное

D Pç5î=0,68.

Полученные результаты показывают, что предложенный сравнительный показатель дифференцирует не только контрастные эндоспермовые мутанты, но и синтетики, позволяющие создавать на основе мутантов селекционные формы с комплексом хозяйственно ценных признаков.

Использование предлагаемого способа в сравнении с прототипом позволит существенно упростить и ускорить проведении отбора путем исключения длительных и трудоемких операций по количественной экстракции и определению белка, Способ исключает использование дефицитных биохимических препаратов и основан на применении разбавленных растворов доступных щелочных реагентов. При этом определение оптической плотности белкового экстракта в качестве маркерного признака является простым приемом, доступным для любой лаборатории.

Способ позволит проводить aKcflpecc отбор форм кукурузы с повышенной биологической ценностью при использовании в селекционной практике генетических приемов, направленных на улучшение качества зерна. (56).Неудачин В. П„Лебедев А. S. Прикладная биохимия и микробиология, — 1984, т. 20, вып, 2, с. 267 — 272, Gentlnetta E. et al, Maydlca, 1975, v. 20, и. 3, р. 145 — 164, Misra Р.S. et a!. Cer, Chem., 1973, ч. 50, п, 2, р. 184 — 190.

Esen A, J. Agric Food Chem., 1980, v, 28, и. 3, р. 529-532.

Wallace J. С. et al, Cer. Chem„1990, ч.

92, и, 1, р, 191-196.

2004144

Таблица 5

Формула изобретения

Составитель В. Демкин

Редактор В. Трубченко Техред M.Moðãåíòàë Корректор Л. Пилипенко

Заказ 3357

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101

СПОСОБ ОТБОРА СЕЛЕКЦИОННЫХ, ФОРМ КУКУРУЗЫ С ПОВЫШЕННОЙ БИ: ОЛОГИЧЕСКОЙ ЦЕННОСТЬЮ, включающий экстракцию белков размолотого зерна исследуемых образцов и контрольных исходных форм в щелочной среде, измерение величины оптической плотности и идентификацию селекционных ценных

: форм, отличающийся тем, что экстракцию

; белков проводят 0,01 — 0,5 М раствором щелочи, величину оптической плотности измеряют при 350 нм и ценные селекционные формы идентифицируют по превышению данного показателя в 1,3 - 2,1 раза у исследуемых образцов над его значением у контрольных исходных форм.