Способ моделирования тотальной ишемии миокарда

 

Изобретение относится к медицине, экспериментальной кардиологии. Сущность: в полостях инкубируемого сердца создают избыточное давление, препятствующее развитию ишемической контрактуры. Предложенная модель ишемического повреждения миокарда позволяет изучать патогенез повреждения сердечной мышцы при ишемической контрактуре и релаксации кардиомиоцитов.

Изобретение относится к медицине, точнее к экспериментальной кардиологии, конкретно к способам моделирования ишемического повреждения миокарда in vitro и может быть использовано в научных исследованиях и учебном процессе студентов медицинских и биологических специальностей.

Известны способы моделирования ишемического повреждения миокарда in vitro, существенным признаком которых является изоляция сердца или его части от макроорганизма с последующей инкубацией в растворах по ионическому и осмотическому составу, близких к сыворотке крови, в условиях полного или частичного отсутствия кислорода.

Основным недостатком указанных способов является невозможность с их помощью получать различные состояния контрактильного аппарата ишемизированных кардиомиоцитов.

Наиболее близким по технической сущности к заявляемому способу является способ создания острой полной ишемии миокарда на переживающем органе. Методика его включает ряд последовательных этапов. Наркотизированному животному производят торакотомию, извлекают бьющееся сердце и после отмывки его от крови в растворе заданного состава (Рингер, Кребса-Хензеляйта, физиологический растворы) помещают в инкубационную среду, сходную по составу с раствором для отмывки, на время определенное задачами эксперимента. Поступая подобным образом создают три основных условия, приводящих к развитию ишемического повреждения, а именно прекращают доставку в орган кислорода и субстратов окисления, а также отток метаболитов. Эти условия приводят к развитию ишемии, что подтверждают гистологически. На этой модели ишемию можно дозировать, меняя температуру, время инкубации и состав среды.

Основным существенным недостатком способа-прототипа является то, что получаемые ишемически поврежденные кардиомиоциты могут находиться только в состоянии контрактуры, тогда как известно, что в реальных условиях в зоне инфаркта наряду с контрактурными всегда имеются релаксированные миоциты. Это существенно суживает возможности изучения патогенеза ишемического повреждения, делая исследование однобоким. Действительно, применяя способ-прототип невозможно изучить развитие деструкции релаксированных клеток, что существенно сказывается на понимании динамики ишемического повреждения.

Целью заявляемого способа является расширение возможностей прототипа путем получения различных состояний контрактильного аппарата ишемизированных кардиомиоцитов.

Указанная цель достигается тем, что в полости желудочков создают избыточное давление 40-50 мм рт. ст.

Сущность изобретения заключается в следующем. Наркотизированное животное подвергают торакотомии, извлекают бьющееся сердце, отмывают его в 100-140 мл растворе (Рингера, Кребса-Хензеляйта, физиологическом), подогретом до 20-40^оС. Затем в полость одного из желудочков или в оба желудочка вводят эластические баллоны, которые раздувают и этим создают механическую нагрузку на миокард, препятствующую развитию контрактуры. Для этого их подключают к устройству, создающему давление 0-50 мм рт. ст. путем нагнетания в баллоны жидкости. Сердца с раздутыми баллонами помещают в 11-12 мл инкубационной среды. Давление в баллонах поддерживают в течение первых 2-3 ч инкубации, общая длительность которой может составлять 2-24 ч. Два предельные значения внутрижелудочкового давления - 0 и 50 мм рт. ст. приводят к развитию двух крайних состояний контрактильного аппарата ишемизированных кардиомиоцитов - контрактуре и релаксации соответственно. В зависимости от задач эксперимента длительность инкубации, температуру и состав среды изменяют. Для подтверждения факта получения заявляемой модели после инкубации сердца подвергают гистологическому исследованию. На препаратах обнаруживают классические признаки ишемии: снижение содержания гликогена, набухание и разрыв митохондрий, фрагментацию мышечных волокон, усиление анизотропии и слияние измененных дисков, комкообразный хроматин, дефекты плазматической мембраны. Последние 2 признака наблюдаются после 12-16 ч ишемии. При этом как контрактурные определяют кардиомиоциты, имеющие длину саркомеров менее 1,3 мкм, как релаксированные миоциты с длиной саркомеров более 1,35 мкм.

Примеры конкретной реализации заявляемого способа.

Белую беспородную крысу 1 заливали под тиопенталовым наркозом (5 мг/кг). Путем торакотомии извлекали бьющееся сердце и отмывали его от крови в 100 мл раствора Рингера, температура которого равна 37^оС. После этого сердце помещали в 12 мл инкубационной среды, сходной по составу с раствором отмывки. Материал инкубировали 12 ч, считая, что избыточное давление в полости левого желудочка равно 0 мм рт. ст. Сердце крысы 2 извлекали и отмывали от крови описанным ранее способом. Для получения релаксированных кардиомиоцитов в полость левого желудочка вводили эластический баллон. Его раздували, создавая постоянное избыточное давление 40 мм рт. ст. Сердце 2 с раздутым баллоном помещали в 12 мл инкубационной среды, сходной по составу с раствором отмывки. Через 2 ч инкубации баллоны из полости левого желудочка извлекали. Общая длительность инкубации сердца 2 составляла 12 ч. После этого сердца помещали в 10% нейтральный формалин не менее чем на 24 ч и готовили парафиновые срезы. Измерение длин саркомеров производили с использованием поляризационно-оптического метода. Применяли микроскоп МБИ-15 с окуляр микрометром, точность измерения которого составляет 0,05 мкм. Определили, что длина саркомеров кардиомиоцитов сердца 1 в среднем равна 1,2+0,1 мкм, а сердца 2 - 1,8+0,2 мкм. На окрашенных гематоксилин-эозином и по ван Гизону препаратах определяли снижение содержания гликогена, разрушение митохондрий, фрагментацию мышечных волокон. Вышеописанное является подтверждением получения заявляемой модели. При этом миокард сердца 1 состоит из контрактурных кардиомиоцитов, а сердца 2 из релаксированных.

Преимущества заявляемого способа заключаются в расширении возможностей способа путем получения различных состояний контрактильного аппарата ишемизированных кардиомиоцитов. То, что получаемый ишемизированный миокард полностью может состоять из контрактурных или релаксированных миоцитов, позволяет раздельно и с достаточной точностью изучать динамику разрушения этих 2 типов клеток. Необходимость подобного рода исследований оговаривалась выше. Важно также и то, что различные состояния контрактильного аппарата получают не химическим путем, последнее позволяет изучать биохимические аспекты, неискаженные условиями эксперимента. На заявляемой модели можно также исследовать биомеханические и иммунологические свойства ишемизированных миоцитов при различных состояниях контрактильного аппарата. Давление, как условие, определяющее различное состояние актомиозинового комплекса ишемизированных кардиомиоцитов, выбрано еще и потому, что этот фактор имеет место в реальных ситуациях. Действительно, ишемизированный участок миокарда в реальных условиях всегда испытывает механическую нагрузку со стороны неповрежденного миокарда. Величина этой нагрузки определяется конечно-диастолическим и конечно-систолическим давлениями в полостях работающего сердца. Последнее может служить одним из свидетельств адекватности модели.

Лабораторные испытания заявляемого способа проведено на 72-х лабораторных беспородных крысах обоего пола.

Формула изобретения

СПОСОБ МОДЕЛИРОВАНИЯ ТОТАЛЬНОЙ ИШЕМИИ МИОКАРДА, включающий перфузию изолированного сердца, отличающийся тем, что, с целью расширения возможностей способа для моделирования тотальной ишемии миокарда с релаксированными кардиомиоцитами, в полостях желудочков создают избыточное давление 40 - 50 мм рт. ст.