Способ выделения рекомбинантного проинсулина

 

Изобретение относится к биотехнологии. Сущность изобретения: разработка более технологичного способа выделения проинсулина с более высоким выходом конечного продукта. Для достижения цели использовали сорбент ДЕАП-сферанит-ОН и новые условия хроматографии, в частности, для элюции применяли 0,2 0,3 М раствор уксусной кислоты в обратном линейном градиенте хлористого натрия от 1,0 до 0 М. 1 ил. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к выделению генно-инженерных инсулинсодержащих белков и их аналогов с помощью методов хроматографии [1-2] Технология представляет собой многостадийный процесс, включающий продуцирование рекомбинантного белка, содержащего последовательность проинсулина человека, его переработку и постадийную очистку.

Недостатками известных методов являются сложная технология выделения, многостадийность, применение импортных дорогих сорбентов, низкие выходы промежуточных продуктов и соответственно конечного продукта.

Прототипом изобретения является способ выделения рекомбинантного проинсулина (ПИ) в процессе получения генно-инженерного инсулина из смеси, получающейся при обработке S-сульфоната проинсулина (ССП) ренатурирующим раствором, содержащим глицин и меркаптоэтанол, путем его пропускания через колонку с ДЕАЕ-сефарозой FF в 30 мМ буферном растворе трис-гидрохлорида с линейным градиентом от 0 до 0,5 М хлористого натрия с последующей ультрафильтрацией и диализом [3] Недостатком прототипа является низкий выход проинсулина (около 35%) и многостадийность процесса.

Целью изобретения является разработка более технологичного способа выделения ПИ, позволяющего получить продукт с более высоким выходом.

Указанная цель достигается путем пропускания реакционной смеси, полученной после обработки S-сульфоната проинсулина ренатурирующим раствором через колонну, содержащую сополимер диметакрилата этиленгликоля (30-50 мол.) с 2-гидрокси-3-диэтиламинопропилметакрилатом (70-50 мол.), названного ДЕАП-сферанит-ОН и элюцией ПИ раствором уксусной кислоты с концентрацией не менее 0,2 М в обратном линейном градиенте хлористого натрия.

Существенными отличиями заявленного способа являются использование для выделения ПИ (непосредственно из реакционной смеси) сорбента ДЕПР-сферанита-ОН и новые условия хроматографии, в частности применение для элюции 0,2 М раствора уксусной кислоты в обратном линейном градиенте хлористого натрия. В результате использования существенных отличий удается исключить стадию обессоливания (диализа) и получить целевой продукт с высоким выходом 65,7% П р и м е р 1 (прототип). Раствор ренатурированного проинсулина v 240 мл доводят до рН 8,0, 240 мг белка вводят в колонку, содержащую 50 мл ДЕАЕ-сефарозы FF, уравновешенную 30 мМ буферным раствором трис-гидрохлорида (рН 7,5), промывают тем же раствором в течение 40 мин и элюируют ПИ линейным градиентом от 0 до 0,5 М хлористого натрия в том же буфере. Фракции, содержащие ПИ (80 мл), концентрируют до 1,2 мл, 84 мг белка с помощью ультрафильтрации на приборе Амикон 8200 (мембрана до 5000). Раствор диализуют против 3-х смен по 300 мл раствора трис-гидрохлорида (рН 7,5) и получают 1,4 мл раствора, содержащего 83 мг (34,6%) ПИ.

П р и м е р 2. Раствор ПИ v 30 мл с рН 10,0, который соответствует рН реакционной среды при ренатурации, содержащий 30 мг белка, наносят на колонку (2,5 х 5 см), содержащую ДЕАП-сферанит-ОН (образец 3), уравновешенную 30 мМ буферным раствором трис-гидрохлорида (рН 7,5), промывают тем же буфером, затем уравновешивают раствором 0,2 М уксусной кислоты с 1 М хлористым натрием. ПИ элюируют обратным линейным градиентом хлористого натрия от 1 М до 0 в 0,2 М растворе уксусной кислоты. Фракции, содержание ПИ, объединяют и получают 50 мл раствора, содержащего 19,7 мл (65,7%) белка.

П р и м е р 3. Выделение ПИ проводят в условиях примера 2, используя сорбенты (ДЕАП-сферанит-ОН) с различным соотношением мономеров.

Данные сведены в табл.1.

П р и м е р 4. Выделение ПИ проводят в условиях примера 2, используя в качестве элюента растворы уксусной кислоты различной концентрации.

Данные сведены в табл.2.

Как следует из приведенных выше примеров, использование предлагаемого способа выделения ПИ позволяет повысить выход почти в 2 раза от 35 до 65,7% с исключением стадии обессоливания. Стадия обессоливания не нужна, так как белок выходит с колонки практически в отсутствии NaCl (см. чертеж).

Формула изобретения

СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ РЕКОМБИНАНТНОГО ПРОИНСУЛИНА из смеси, образующейся при ренатурации проинсулина из S-сульфоната проинсулина при получении инсулина методом генной инженерии, включающий сорбцию его на сорбенте и элюцию растворителем, отличающийся тем, что, с целью упрощения технологии и повышения выхода целевого продукта, реакционную смесь, содержащую ренатурированный проинсулин, пропускают через колонку с сополимером диметилакрилата этиленгликоля (30 50 мол.) с 2-гидрокси-3-диэтиламинопропилметакрилатом (70 50 мол. ), а элюцию проводят раствором уксусной кислоты с концентрацией 0,2-0,3 М в обратном линейном градиенте хлористого натрия от 1,0 М до 0.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2