Способ получения инсулина человека

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения инсулина человека из инсулина свиньи. Цель изобретения - упрощение способа. Способ состоит в обработке производных инсулина инс-тре-NH<SB POS="POST">2</SB>, инс-тре-тре-NH<SB POS="POST">2</SB> или инс-тре-OCH<SB POS="POST">3</SB>, где инс-дез-тре (ВЗО)-инсулин человека, карбоксипептидазой Y из дрожжей, которая катализирует обмен остатка аланина в положении В 30 на треонин. В качестве источника треонина используют его производные, в частности треонинамид. Способ позволяет получить инсулин человека короткой, простой процедурой.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (11) ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР, (2i) 3825251/30-14 (62) 3414346/30-14 (22) 18.12.84 (23) 23.07.81 (31) 3197/80 (32) 24.07.80 (33) DK (46) 30.11.90, Бюл. ¹ 44 (71) Карсберг Биотехнолоджи Лтд А/С (ПК) (72) Бреддам Клаус, Еханс!- н Джек

Таанинг (ЭК) и Видмер Фред (СН) (53) 612. 018 (088.8) (56) Horihara К.. — Nature, 1979, 280, № 5721, р „412-413, Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения инсулина человека из инсулина свиньи.

Цель изобретения — упрощение способа, достигаемое за счет устранения трудоемких операций предварительной обработки инсулина и снятия защитных химических группировок, а также сокращение времени проведения реакции.

Способ основан на новом свойстве дрожжевой карбоксипептидазы — Y превращать инсулин свиньи в инсулин человека в результате обмена остатка аланина, находящегося в положении

В 30, на треалин (источник треонина— производное треонина в среде инкуба— ции) в одну стадию без выделения промежуточного продукта.

Способ осуществляется следующим образом. (51) С 07 К 3/08, А 61 К 37/26

2 (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕШИ ИНСУЖПЗА ЧЕЛОBE КА (57) Изобретение относится к биотех— нологии и может быть использовано для полу;ения инсулина человека из инсулина свиньи. Цель изобретения — упроще!ше способа. Способ состоит в обработке производных инсулина инс-тре11Н, ил с — тре-тре-NH I:IIH инс-тре-ОСН >, где инс — дез-тре (В 30) — инсулин человека, карбоксипептидазой 7 из дрожжей, которая катализирует обмен остатка аланина в положении В 30 на треонин. В качестве источника треонина используют его прозводные, в частности треонинамид,. Способ позволяет получить инсулин человека короткой, простой процедурой,. 2 табл.

Производные инсулина инс-тре-NH

2 инс — тре — тре-NH или инс-тре-ОСН

2 Зт где инс-дез-тре (В 30) — инсулин че—

JIoBeica, инкубируют с дрожжевой карбоксипепидазой Y и производным треошша при р11 7,5-10,0. Предпочтительным производным треонина является трео— нинамид. Реакцию проводят в водной среде, которая может содержать до 507. объема органического растворителя, причем выбор растворителя зависит от растворимости компонентов реакционно).. среды.- Реакционная среда может также содержать мочевину или хлоргидрат гуанидина в концентрации до 3 И„ Оптимальная концентрац1!я инсулина

0 002-0 05 М, фермента 10 -10 И, треопипамида 0,05-3,0 М, температура о

20-40 С. Эти параметры могут варьировать в широких пределах !! определя— ются c!IåðIIìeIIòaëüI!î.

1(>1121 7

П р и M е р 1 lip e <)р)г((ни<> (313ино г<. Инсулина в инсул}п} че>}овек;3 с использованием 13 качестве;If(HHII<)I f(<)M понента теронинлминл и с и:3ол ttèåfl tl

<ромежуточш гх инсулинолгг}гдов и послед лощля де злмидизлция }3 соотве, (. f f3èè с изобретением.

К раствору не с(>держащего цинка свиного инсулина (2 мМ) в 2 мМ ЭДТА 10

0,1 М КС1 и 1,5 М хлоргидратл гулнид ша, содержащего 0,5 М треонинлмидл (g тре — ИН, ) при pll 7,5 и 25 С доблвляют клрбоксипептидл зу-У (15> мкМ), 3ffaО (.тся в результате г(ftttef М раствора соляной кислоты„ Фракцию, содержащую инсулин, отделяют От ff>HMa и низкомолекулярных компоненто}3 в 25 результате хроматографирования на колонке 1х30 см, заполненной "(.ефадек—

"ом Г-50 мелким" с использованием в качестве растворителя 1 М раствора уксусной кислоты, и лиофилизируют ее. 30

Проведенный согласно описанному выше способу анализ аминокиснотного состава лиофилизированного инсулина показывает, что 787. свиного инсулинл расходуется в ходе реакции. 35

Для дальнейшего анализа реагентов, содержащихся в "инсулиновой пробе" проводят хроматографирование на ионообменном "(.е<>адек(л-11ЕА1 . Л-25 Образец лиофилизированног(> инс улина 40 (75 мг) растворяют в 0,,01 M ТРИС, 2,5 М мочевине, 0,05 М 1)1лС1„при р11 7,5 и хроматогрлфируют на колонке, 3;ftfot}ненной " e<,>адексом-ДЕАН А-25" (2,5х х2,5 чсм) с использова:<ием в качестве 45 растворителя того же самого буферного раствора. Инсул}1}1 элюируют растворами хлористого натрия с градиентом концентраций от О, 05 до О., 30 М в том же буфере, собирают фракции по 8 мл на ко- .

)О лонке, заполненнои "Сефлдексом Г-25" и лиофилизируют их.

Профиль состоит из трех пиков, Кроме того, определяются составы aM}t»o— кислот и со< тлв веществ пиков в резуль3 тате обработки клрбоксипептидазо} (см„ табл„ 1).

П<3скотг}.ку в указанных реакциях участвуют топь кО (ко}<еп fleïH В инсулина ) В К 1 Ч Е С Т13 Е МО/I < .IIÈ C 131 1 H О Г О И Н С P . f H Н Л и<:поль зуетсн 1}оследов;1T <ьность -про>И}.3 л)}л — (Nl, А}Залоги 1 ff IM Обра 3<>M сокра}цен}г}1 для других пр Ои.313одных инсу::ина пр еде тл}3>1>}ют с О бой: — про-ли:3-тре — OH для инсулина человекл (-про-лиз-треNil ) для инсулинлмидл человека и т.д, При рН 7,5, которое используется в х<)де реакции, при котором амида Зная активность кар боксипептидазы — Y обьгчно ниже, чем ее пептида зная активность, <> ()p tl f3 vf<>1IlHHc >I пе1 1 ти цамид 13 з нл чит ель ной мере стабилен, поскольку пик I соотвеTcTI>yew- примерно 207. всего количества инсулиновой пробы,.

В процессе реакции превращается примерно 75Z исходного свиного инсу:пгнл. Однако, хотя содержание треонинл 13 пике I (3„(>5) больше, чем 3,0 соответству}ощее инсулину человека, очег>}гг(но, что первонлчлльнь и продукт транспептидирования (-про-лиз-Tpe — NH )

1fe является достаточно стабильным для того, чтобы не ггроисход}г1}а олигоме— ризлция с образованием (-про-лиз-тре11Нг)"

На первый взгляд Обрл зов лние смеси промежуточных амидов может говорить о том, что в результате описанной ранее стадии дезамидирования посредством карбоксипептидазьг-г не образуется чистый инсулин человека, поскольку в результате дезамидпрования очевидно следует ожидать получения смеси -npoJIHAD-тре-OH и -про †л-тре-тре-ОН„

Однако при обработке вещества пика I с целью дезлмидирования согласно изобрете}ппо 10 мкМ карбоксипептидазы-Y при рН 10,0 в 0,1 M HC1 2 мМ ЭДТА в течение 20 мин получают нео><жданно практически чистый инсу.гин человека.

Этот опыт протекает следующим образом, После отделения прореагировлвшего инс>,ина От эн. Зима и низкомолекулярных продуктов хроматографированием на

"Сефадег(се Г-50" полученный продукт хроматографиручот на "ДЕАЕ-Сефадоксе

А-25" с испоггьзованием способа, ана— логично описанному вьш}е. Продукт реакции элюируется в пике II, что и ожидалось, тогда как непрореагировавший продукт (менее 10K) элюируется в пике 1. Пик III вообще отсутствует, T.å. производные инсулина, не содержащие лизина, не образуются B ходе релк}1}ги,. Б результате обработки карб<>f(CHtfeltTH;faaaftH A H Y H T}>HrtCHff<>M yf(a— злннля реакция влияет т<>г<ько на содер16112

20 амиду аминокислоты, а — про — лиз-тре— тре — NH> реагирует главным образом при наличии амидазной активности, Общий выход для превращения свиного инсулина в инсулин человека составляет примерно 307 из расчета на превра— щенный инсулин„

Та блица 1

Лминокислота

I II III

II, полученный после дезамидирова35 ния пи к, I жанне треонина в сколь-нибудь значительной степени. Это находится в соответствии с ожидаемым отсутствием пептидазной активности карбоксипептида5 зы-7 при данном значении рН„

Состав аминокислот для пика II полученного при реакции дезамидирования, близко к составу инсулина человека: тре = 2,87, ала = 1,05, лиз = 0,98. Обработка продукта дезамидирования карбоксипептидаэами Y и Л и трипсином показывает, что образец содержит 90-96/ чистого инсулина человека„ Это утверждение сделано в предположении, что производное ин— сулина -про-лиз-тре-тре-NH< реагирует практически только при наличии гидролазной активности к пептидил17 6

Пример 2..Инсулинамид че2 ловека (инс-тре-NH ) в количестве 11 мг растворяют в 1 мМ ЭДТА и 2 мМ .ЕГ (2 мл), рН доводят до 9,0 добавлением 51 мкл 0,5 М ИаОН и вводят в смесь 50 мкл карбоксипептидазы-Y (13,6 мг/мл). Через 15 мин реакцию останавливают введением 25 мкл 6 М

НС1, доводя рН до 1,2. Реакционную смесь разделяют на нСефадекс= Г-50" и элюируют 1 М раствором уксусной кислоты. Получают 8 мг инсулина человека (доказано анализом аминокислотного состава)„

Пример 3. 5 мг метилового эфира инсулина человека (инс-тре-ОСН ) растворяют в 1 мл 0,1 1"I КС1 с 1 мМ

ЭДТЛ при повышении рН с 4,5 до 8,.5 добавлением NaOII. Этот диапазон рН сохраняют в рН-стате с использованием

0,05 М ИаОН в качестве титранта при комнатной температуре. Реакцию начинают добавлением 1 мкг дро юкевой карбоксипептидаэы, растворенной в 10 мкл воды„ За ходом реакции следят с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Спустя 1 ч 10 мин гидролиз завершается. Реакционную смесь подвергают гель-фильтрации в 307.-ной уксусной кислоте на "Сефадексе Г-50", Выход, определенный с помощью А д, составил 4,8 мг человеческого инсулина.

Лминокислотный анализ состав приведен в табл. 2.

Та блица 2

Аспарагиновая кислота 2,99

Треонин 3,62

Серии 2,93

ГлютаминоЛминокислота Содержание Содержание по формуле по анализу

3,01

2,50

2,92

-",99

2,52

2,92

3,01

2,79

2,93 вая кис6,88

1.00

4,00

1,16

0,94

2,42

5 80

3,80

7,16

0,98

4,00

1,52

1,04

2,82

6,21

3,86

7,18

0,71

4,00

1,03

1,09

2,81

6,18

3,67

7,01

0,87

4,00

1,09

1,19

2,50

6,10

4,02

2,82

1,90

0,74

1,00

2,74

1,96

0,99

0,96

2,65

1,93

1,06

0,98

2,64

1,89

1,01

0,89 алании

Гистидин

Лизин

Аригинин лота

Пролин

Глицин

Аланин

Идейцин

Валин

Лейцин

Тир озин

ФенилЛсп

Тре

Сер

Глу

Про

I JIH

Лла

Цис

Вал

Иле

Лей

Тир

Фен

Гис

Лрг

Лиз

3

7

4

6

2

4

2

3,00

2,83

3,00

7,09

0,76

4,00

1,07

4,67

2,88

1,97

6,18

3,89

2,89

1,86

0,97

0,98

1 11317

Соста»»»»тель 11. 1 уляе«а

РеДактоР 11. КасаРда ТехРед i! У„да<»<»»

Корректор Г - .1а<.<»е»» » ир аж 3 1 9

11< .лис«ое

З..каз 3746

Б11ИИ;111 (î< уд<»р«тле»<»<о» о к<»иитета по»»зобрет<ы»<»»»м и открыти. и пр<» К11Т Г<".,1:Г

11 )035, Ìî<»â;»,, 8-35, Рву<»к к«я наб., д. 4,< з!

1ро»»звон< тне««о — . s:»«òе:»b<. кий комб<»«ат "11«"<. нт,; .Уж«про,», г... «гари»а 01

Изобретение позволяет у»тростить известный способ полу ения инсу тина человека и сократить время его реализации за счет сокращения -»»сла тру5 доемких операций.

Ф о р м у л а и з î 6 р е т е н и я

Способ получения инсул:-»на человека путем обработки производных инсулина карбоксипептидазой с последующим выделением целевого продукта, î т» и ч а ю щ !» и с я тем, <»т<, с целью упр<я »е»»ия способа, в качестве производных и»»сул»»»»а используют инс — тре—

%!, инс-тре-тре-%1 или инс-тре-ОСН

2 9 г;»е инс-дез — тре (В 30) -инсулин чело—

«ека, а в качестве карбокс»»г»ептидазы дро,»о«евую карбоксипептидазу-У,причем обработку проводят »3 растворе или I»»c— персии при р11 7,5-10,0„