Рекомбинантная плазмидная днк pes78vcs-источник зонда для идентификации холерных вибрионов и штамм бактерий еsснеriснiа coli - продуцент рекомбинантной плазмидной днк pes78vcs

 

Использование; медицинская микробиология . Сущность изобретения: зонд полученклонированием фрагмента хромосомной ДНК холерного вибриона в составе плазмидного вектора р UC 18. Продуцентом рекомбинантной плазмиды pES78VCS является штамм E.coL.i KM-57. ДНК-зонд получают из рекомбинантной плазмиды после ее гидролиза рестрикционной эндонуклеазой Hind III, электрофореза и элюции клонированного фрагмента из геля . В качестве зонда могут быть использованы как целый фрагмент, так и его участки, образующиеся в результате гидролиза Xho I и Hinc III. Радиоактивную метку / а32Р/ АТР вводят в ДНК методом ник-трансляции. Из 24 исследованных видов бактерий с зондом гибридизуются только представители биологического вида Vibrio chobrac. Рекомбинантная плазмида может служить источником ДНК-зонда и использоваться для совершенствования схемы идентификации холерных вибрионов. со с

I:ОКЭЗ СОВГ1СКИХ

СОЦИЛЛИГТИ 1ГСКИХ

РЕСПУГ,ИИК

<я)з С 1» 0 1/58, С 12 N 15/31

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТИITHOF

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4881467/13 (22) 11.11.90 (46) 07.04.93. Бюл. М 13 (71) Ростовский-на-Дону государственный научно-исследовательский противочумный институт (72) Е.В.Монахова, В,П.Власов, Е,И.Седых и

В.H.Âóöàí (56) Harford N. et al. Clonlng and Characterization of Vibrio cholerae toxin genes in Е.

coll// Bat. protein toxin — London) Асад, pres — 1984, с. 75, (54) РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ

ДНК pES78VCS-ИСТОЧНИК ЗОНДА ДЛЯ

ИДЕНТИФИКАЦИИ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA

COLl-ПРОДУЦЕНТ РЕКОМБИНАНТНОЙ

ПЛАЗМИДНОЙ ДНК рЕЯ78ЧСЗ (57) Использование: медицинская микробиология. Сущность изобретения: зонд получен клонированием фрагмента

Изобретение относится к биотехнологии, медицинской микробиологии, генной инженерии и может быть использовано для совершенствования схемы идентификации холерных вибрионов.

Цель изобретения — создание ДН К"зонда для идентификации холерных вибрионов и штамма Е.соИ вЂ” продуцента источника зонда — рекомбинантной плазмиды, содержа щей в своем составе клонированный видоспецифичный < участок геномной ДНК

Ч.choterae eitor.

Рекомбинантная плазмида pES78VCS содержит репликон вектора pUC18, по Hind

III-сайту которого встроен фрагмент ДНК размером 1,74 т,п.н.. полученный иэ хромосомы Ч.cholerae eltor 9337. Плазмида не„., 5U„„1807081 А1 хромосомной ДН К холерного вибриона в составе плазмидного вектора р LIC 18. Продуцентом рекомбинантной плазмиды

pES78VCS является штамм Е.coL КМ-57.

ДНК-зонд получают из рекомбинантной плазмиды после ее гидролиза рестрикционной эндонуклеазой Hind III, электрофореэа и элюции клонированного фрагмента из геля, В качестве зонда могут быть использованы как целый фрагмент. так и его участки, образующиеся в результате гидролиэа Xho! и Hlnc lli. Радиоактивную метку /a Р/ ATP вводят в ДНК методом ник-трансляции. Из

24 исследованных видов бактерий с зондом гибридизуются только представители биологического вида Vibrio chobrac. Рекомбинантная плазмида может служить источником ДНК-зонда и использоваться для совершенствования схемы идентификации холерных вибрионов. конъюгативна, амплифицируется при добавлении в культуральную среду хлорамфеникола (160-200 мкг/мл). Синтез и накопление

ДНК-зонда происходит в процессе репликации рекомбинантной плаэмиды за счет репликона вектора pUC18, В результате гидролиза плазмиды рЕ$78ЧС5 эндонуклеазой Hind III от векторной части отщепляется интактный клонированный фрагмент длиной 1,78 т.п.н. Этот фрагмент строго специфичен для холерных вибрионов и может служить в качестве зонда для их идентификации. В пределах этого фрагмента имеются сайты для Mine II, Xho I и Sph 1, расположенные относительно друг друга следующим образом:

1807081 цектОР H nctt Xbo I BgKTttp

Hind m Sph 1 Sph 1 Hind a

В качестве видоспецифичного зонда для идентификации холерных вибрионов может быть использован не только целый

Hind III — Hind III — фрагмент 1,74 т.п,н., но также и составляющие его участки: Hind 1П—

Xho I — 1,34 т.п.н., Xho I — Hind П! — 0,4 т.п.н, и Hin II — Xho! — 0,65 т,п.н.

Штамм-и родуцент зонда получен трансформацией клеток Е.coi: НВ101 плазмидой

pES78VCS. Присутствие в штамме рекомбинантной плазмиды подтверждается способностью клеток образовывать колонии на агаре с ампициллином (50 мкг/мл), а также продуцировать плаэмидную ДНК, из которой при гидролизе Hind lit выщепляется фрагмент размером 1,74 т,п.н. Выход плаэмидной ДНК из клеток продуцента в стационарной фазе роста составляет 2-3 мг/л бульонной культуры..

Штамм характеризуется следующими признаками.

Культурально-морфологические и другие признаки.

Клетки в мазках неотличимы от таковых исходного штамма и имеют вид грамотрицательных палочек. На плотных средах образует круглые выпуклые гладкие бесцветные полупрозрачные колонии, В жидких средах образует помутнение и осадок. Устойчив к ампициллину (50 мкг/мл).

Биохимические свойства, Ферментируетс образованием кислоты беэ газа глюкозу и маннозу, не ферментирует маннит, сахарозу и лактозу, образует декарбоксилазу лизина, не образует декарбоксилазы орнитина,дигидролазы аргинина,лецитиназы,, гемолизинов.

Лизируется кишечными фагами Тз и Ту, не лизируется il CI и холерными фагами "С и "эльтор".

По питательным потребностям — ауксотроф

Содержит рекоминантную плазмиду рЕ$78ЧС$, обусловливающую устойчивость к ампициллину, Штамм Е.coll — продуцент рекомбинантной плазмиды депонирован во Всесоюзном научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" под номером КМ-57.

Способ получения и использования штамма иллюстрируется примерами.

Пример 1. Получение библиотеки фрагментов ДНК Кcholerae. отбор видеоспецифичного фрагмента и его клонирование в составе плаэмидного вектора pUC18.

Хромосомную ДHK, выделенную из культуры Кcholerae eitor 9337 фенольным методом, гидролизовали зндонуклеазой рестрикции Hind Itl в течение 2 ч при 37 С, Состав реакционной смеси: хромосомная

ДНК 10 мкл (5 мкг): Hind 1П 60 ед,: 10" буфер для Hind III 10 мкл; Н О до 100 мкл, Параллельно в тех же условиях расщепляли Hind III плазмиду pBR322 и обрабатывали щелочной фосфатазой для удаления концевых фосфатов, К 15 мкл расщепленной хромосомы прибавляли 1 мкл (0,3 мкг) расщепленной плазмиды, 3 мкл 10" буфера для лигирования и

30 ед, ДНК-лигазы, Смесь доводили дистиллированной водой до 30 мкл и инкубировали в течение ночи при 12 С. Реакцию останавливали прогреванием при 60 С в течение 10 мин. Этой смесью трансформировали ком20 петентные клетки Е.coll HB101, полученные при помощи обработки 0,1 М CaCtz при 4 С в течение ночи. После трансформации культуру высевали на агаризованную среду LB, содержащую 50 мкг/мл ампициллина, и инкубировали при 37 С. Через сутки выросшие колонии с каждой чашки переносили бархатным штампом параллельно на 2 чашки с агаром LB — одну с ампициллином (50 мкг/мл), другую — с тетрациклином (10

30 мкгlмл) и инкубировали в течение суток при

37 С. Встраивание чужеродной ДНК в плазмиду PBR322 по сайту Hind III приводит к утрате обусловливаемой данной плазмидой устойчивости к тетрациклину; устойчивость

35 к ампициллину сохраняется. Поэтому рекомбинантные клоны отбирали по признаку

Ар Tet, Из 12 различных по размерам встроенных фрагментов ДНК вибриона рекомби40 нантных плазмид (случайная выборка) с помощью эндонуклеазы Hind (И были получены соответствующие фрагменты и испытаны на видоспецифичность в качестве молекулярных зондов, Радиоактивную мет45 ку (32Р AТP или 32Р-СТР,,r. Ташкент, межреспубликанское объединение В/О

"Изотоп") вводили с помощью ник-трансляции.

Гибридизацию проводили на нитроцел50 люлозных фильтрах после получения на них отпечатков колоний Кспо!егае 01 ине01

° (1 50 штаммов), и 12 других видов рода Vibrio (всего 37 штаммов), а также шигелл, сальмонелл, аэромонад, алломонад, псевдомонад

55 и E.colt (всего 25 штаммов) и их соответствующей обработки с использованием модифицированного метода Caml 3 Kouritsky (NAR—

1978. т — чо1, 5. — P.2381). Нитроцеллюлозные фильтры с фиксированной на них ДНК погружали в раствор для предгибридизации

1807081 (2"SSC, 0,2% SDS, 5" раствор Денхардта, 100 мкг/мл ДНК из спермы лосося) и инкубировали в течение 2 ч при 68"С, после чего переносили в гибридизационный буфер (4."

SSC, 0,2 SDS, 2" раствор Денхэрдта, 100 мкг/мл ДНК из спермы лосося), в котором предварительно растворяли в меченные Р

ДНК-зонды, и инкубировали при 68 С в течение 18 ч, По окончании гибридизации фильтры отмывали раствором, содержащим

2" SSC и 0,2 SDS. дважды по 10 мин при комнатной температуре и 40 мин при 68 С, высушивали при 80 С в течение 2 ч и авторадиографировали на рентгеновской пленке в течение 24-48 ч с использованием усиливающих экранов.

Учет результатов гибридизации после проявления радиоавтографов показал, что только один из исследованных фрагментов положительно реагировал со всеми представителями биологического вида

V.cholerae, включая биовары классический и эльтор, серовэры Инабэ, Огава и Гикошима, измененные формы холерных вибрионов, не поддающиеся типированию серовароспецифическими сыворотками, и штаммы не

01 группы, и не гибридизовался с ДНК ни одного из других видов вибрионов и микроорганизмов кишечной группы, Этот фрагмент был отобран для дальнейшей работы и переклонирован в составе вектора pUC18.

Гидролиз вектора pUC18 и его лигирование с фрагментом 1,74 т.п.н. проводили так же, как описано выше для вектора

pBR322. Лигазной смесью трансформировали штамм Е.coli; 3в 103 После трансформации культуру высевали на агэризованную среду 1 В, содержащую 50 мкг/мл ампициллина, 40 мкг/мл индикатора j3-галэктозидазной активности X-gal и.240 мкг/мл индикатора Р-галэктозидазы ИПТГ(изопропил p -D-тиогалактопиранозид); Через сутки на чашках вырастали колонии трансформантов. Рекомбинантные клоны были отобраны по отсутствию Р-галактозидазной активности, поскольку у них нарушеч синтез этого фермента вследствие сдвига рамки его считывания при встраивании в векторную плазмиду фрагмента чужеродной ДНК.

Из клеток рекомбинэнтных клонов была, выделена плазмидная ДНК, гидролиз которой зндонуклеазнай Hind lii с последующим электрофорезом в 0,77; агарозе показал, что рекомбинантная плазмида содержала фрагмент 1,74 т.п,н. с Hind 111-сайтамина концах. Соответствующая рекомбинантная плазмидэ получила название рЕ$78ЧС$ и в дальнейшем была трансформирована в штамм E coil HR101, в результате чего был получен штамм продуцент рекомбинэнтной

ДНК KM-57.

Пример 2, Использование рекомби5 нантной плазмиды pES78VCS в качестве источника ДНК-зондов для идентификации холерных вибрионов и их применение.

Из стационарной жидкой культуры продуцента выделяли плазмидную ДНК, В ре10 зультате гидролиза плазмиды pES78VCS

Hind ill от векторной части отщепляется интактный клонированный фрагмент длиной

1,74 т,п.н, Совместный гидролиз эндонуклеазами Hind Ill u Xho1 приводит к образо15 ванию двух фрагментов бактериальной ДНК вЂ” 1,34 и 0,4 т.п.н. При гидролизе плазмиды

Hind I l u Xhol можно получить фрагмент ДН К

V.cholerae из центральной части вставки размером 0,65 т.п,н. Все три названных

20 фрагмента обладают такой же абсолютной видоспецифичностью по отношению к

V.choierae, кэк и интактный Hind III — Hind

III — фрагмент и могут быть использованы в качестве зондов для идентификации.

25 Для получения зондов ДНК плазмиды рЕ$78ЧС$ подвергали гидролизу соответствующими эндонуклеазами, разделяли фрагменты в 0,7 агарозном геле, окрашивали бромистым этидием, вырезали из геля нуж30 ные фрагменты в УФ-свете и элюировали иэ геля с помощью прибора для электроэлюции.

Колонии идентифицируемых микроорганизмов, выращенные нэ плотной пита35 тельной среде, отпечатывали на нитроцеллюлозных фильтрах, подвергали соответствующей обработке и гидридизовали с мечеными зондами. Все процедуры. проводили так же, кэк описано в примере 1.

40 В качестве идентифицируемых микроорганизмов были использованы 1316 штаммов V,cholerae 01, 247 штгммов Ч.cholerae поп01, 109 V,parahaemolytlcus, 6. V.aiglnolytlcus, 3 Ч.mlmlcus, 8

45 Ч,гпетзсЬпй!чН, 6 V.fluvialis, 2 V.splendidus, 7 Ч.vulnificus, 3 Ч.pelagius, 1

V.diazotrophlcus;, 1 Ч. cam р Ье!И I, 3

V.damsela, 1 V.gollizae, 1 Ч.ап9ШИагогп, 1

V;orientaIls, 1 Ч.proteotytlcus, 8 $а!вопеИа

50 spp, 5 Shigella spp, 14 Aегоmonas spp, 1

Allomonas sp., 2 Preudomonas sp, 3

Comamonas sp., 10 Е.coli.

Интактный видоспецифичный участок

ДНК и его фрагменты гибридизовались со

55 всеми штаммами Ч.cholerae 01 и не 01 и не гибридизовались ни с одним из штаммов других видов. Результаты идентификации с помощью зондов подтверждены бактериологическими методами.

1807081

Составитель Е,Монахова

Техред М,Моргентал Корректор H.Ревская

Редактор Т.Иванова

Заказ 1361 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", r. Ужгород, уп, Гагарина. 101

Таким образом, сконструирован видоспецифичный зонд для идентификации холерных вибрионов и получен штамм Е.со11— продуцент источника зонда —, рекомбинантной плазмиды рЕ$78ЧС$;

Формула изобретения

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК

pES 78 ЧС$ -- источник зонда для идентификации холерных вибрионов размером 4,43 т.п,о.. содержащая Hind III — Hind II I фрагмент хромосомной ДНК холерного вибриона размером 1,74 т,п.о.. с сайтами рестрикции: Xho 1, Hind II и 2 Sph I внутри фрагмента; Hind III-EcoRI — фрагмент ДНК вектора pUC18 размером 2,6 т.п,о. с сайтами рестрикции, характерными для данного вектора; EcoRI-Hind 111-полилинкер размером

54 т.п.о. с kind lli-сайтом для клонирования

5 фрагмента хромосомы холерного вибриона: генетические маркеры, гены, регуляторные последовательности; ген Ыаф -лактамэзы, обеспечивающий устойчивость к ампициллину; ген репрессора Iас-оперона; N-конце10 вой участок гена Р-галактозидазы.

2. Штамм бактерий Escherichla coll КМ57 — продуцент рекомбйнантной плазмидной ДНК рЕ$78ЧС$.