Синтетическая твердая питательная среда для получения спор несовершенного гриба drechslera teres (sacc.) shoem

 

Использование: в сельскохозяйственной фитопатологии. Сущность изобретения: синтетическая твердая питательная среда для получения спор несовершенного гриба Drechslera teres (Sacc. ) Shoem содержит, г: лактоза 19,4 - 18,00; мочевина 1,164 - 1,08; калий фосфорнокислый однозамещенный 0,485 - 0,45; магний сернокислый 0,485 - 0,45; калий хлористый 0,485 - 0,45; агар-агар - 19,40 - 18,00; вода (мл) 970,00 - 900,00; среда Игла (мл) 30,00 - 100,00. Использование среды позволяет интенсифицировать процесс спороношения гриба в 7,4 раза, упростить диагностику патогена. 2 ил., 3 табл.

Изобретение относится к фитопатологии, а именно к культивированию патогенного несовершенного гриба Drechslera teres (Sacc.) Shoem. вызывающего сетчатую пятнистость ячменя, на синтетической твердой питательной среде, и может быть использовано в микрологии и сельскохозяйственной фитопатологии в лабораторной практике.

В последние годы появилось много сообщений о поражении ячменя сетчатой пятнистостью. Заболевание относится к числу широкораспространенных и наиболее вредоносных. Потери урожая составляют, в Канаде 14-34,7 (McDonald W.C. Buchannon K. W. 1964; Rintelen J. 1969); в Австралии 17,4-37 (Shipton W.A. 1966; Khan T.N. 1987); Великобритании 30-40 (King J.C. 1972); Марокко 26-51 (Caddel G. L. Wilcoxson R.D. 1975); Египте вплоть до 100 (Harrabi M. Kamel, A. 1990).

В нашей стране в результате инфекции недобор урожая составляет, в Латвии и на Южном Урале 20 (Гайке М.В. 1977; Кушниренко И.Ю. 1987); в Белоруссии 30 (Андреев А.С. и др. 1986); в Краснодарском крае 26-32 (Сиренко А.С. 1990); в Эстонии 11,1-31,2 (Талвоя П.А. 1987), в Северном Казахстане до 30 (Хасанов Б. А. и др. 1990). Заболевание мало изучено и продолжает прогрессировать. В связи с этим возросла интенсивность научно-исследовательских работ в области защиты ячменя от сетчатой пятнистости.

Для успешного решения проблемы иммунитета ячменя к сетчатой пятнистости необходимо проведение исследований в генетико-популяционном плане и в направлении оценки болезнеустойчивости сортимента ячменей. Для этих целей требуется в большом количестве конидиальный материал в чистом виде без сопутствующих гифальных фрагментов воздушного мицелия. Это сопряжено с большими трудностями. В связи с этим ряд исследователей применяют мицелиальный или мицелиально-конидиальный материал (Smedegaard-Petersen V. 1971; Sharma H.S. S. 1984), что снижает ценность результатов исследований или сводит ее на нет из-за невозможности применения однообразного инокулюма во всех вариантах исследований, трудности подсчета гифальных фрагментов в единице инокулюма из-за их несоразмерности, более низкой агрессивности мицелиальной суспензии в сравнении с конидиальной и т.д.

Для споруляции гриба D.teres применяются следующие питательные среды: картофельно-сахарозная (Reis E.M. Selective medium for isolating Cochliololus sativus from soil. Plant Disease, 1983, V.67, N 1, Р. 68-70); картофельно-декстрозная (Чумаков А.Е. и др. Основные методы фитопатологических исследований. М. Колос, 1974, с. 84; Наумова Н.А. Анализ семян на грибную и бактериальную инфекцию. Л. Колос, 1970, с. 208); агаризованная среда с экстрактом листьев арахиса и овсяной мукой (Speakman J. B. Pommer E.H. A simple method for producing large volumes of Pyrenophora teres spore suspension. Bull. Brit. Micol. Soc. 1986, 2, 129-130); среда с томатной пастой (Al-Tikrity M.N. A simple technique for production of Drechslera teres spores. Trans. Brit. Mycol. Soc. 1987, V. 89,3, 402); картофельно-морковная (Janosova M. Studium kultivacie huby P. teres na agarovych zivnych podach. Ved. pr. VU rastl. vyroby Piestanoch oblin. a struk. 1988, 122, 19-27); низкосахарная картофельно-декстрозная (Frank J.A. Cole H. Jr. The influence of common root rot on net blotch of winter barley. Phytopathology, 1987, V. 77, N 10, Р. 1454-1457); с мукой фасоли Лима (Sharma H.S.S. Assessment of the reaction of some spring barley cultivars to P.teres using whole plants detached leaves and toxinbioassay. Pl. Pathol. 1984, 33, 371-376); c V-8 соком (Miller P.M. V-8 juice agar as a general purpose medium for fungi and bacteria. Phytopathology, 1955, 45, 6, 461-462).

Наиболее близкой по сущности, функциональному назначению и достигаемому положительному эффекту к предлагаемому изобретению является модифицированная Бенкеном и другими среда Чапека с лактозой и мочевиной (Бенкен А.А. Гайке М. В. и Хацкевич К. Сетчатый гельминтоспориоз ячменя. Труды V Всесоюзного совещания по иммунитету растений. Вып.5. Зерновые культуры, Киев, 1969, с. 38-42), содержащая, г: Калий фосфорно-
кислый однозаме- щенный 0,5 Магний серно- кислый 0,5 Калий хлористый 0,5 Мочевина 1,2 Лактоза 20,0 Агар-агар 20,0
Вода дистилли- рованная, мл до 1000,0
Модифицированная Бенкеном и другими среда Чапека применяется всеми отечественными исследователями, работающими с D. teres в Ленинградской области (Афанасенко О. С. и др. 1976; Петрова А.Н. 1981), Прибалтике (Гайке М.В. 1977), на Южном Урале (Кушниренко И.Ю. Афанасенко О.С. 1984; Левитин М.М. и др. 1986), в Белоруссии (Мицкевич В.К. 1987).

На всех вышеперечисленных средах, в том числе прототипе, гриб образует мало спор, продуцируя большое количество воздушного мицелия (табл.1), из-за которого при фильтрации суспензии выход спор невелик. Кроме того, требуются временные затраты (от 23 до 40 дн) для выращивания инфекционного материала.

Таким образом, все вышеперечисленные среды, в том числе и среда-прототип, не позволяют получать в короткие сроки в больших количествах споровый материал без продуцирования сопутствующего вегетативного мицелия, препятствующего отделению спор при приготовлении суспензии.

Целью изобретения является разработка более качественной синтетической твердой питательной среды, обеспечивающей высокую репродуктивную активность выращиваемого на ней гриба D.teres без продуцирования воздушного мицелия или с минимальным его количеством.

Цель достигается тем, что синтетическая твердая питательная среда, включающая источники углерода, азота, калий фосфорнокислый однозамещенный, магний сернокислый, калий хлористый, агар-агар, воду, дополнительно содержит аминокислоты, витамины, минеральные соли, белок сыворотки, глюкозу, антибиотики, фенол красный при следующем соотношении компонентов, г:
Калий фосфорно-
кислый однозаме- щенный 0,45
Магний серно- кислый 0,45 Калий хлористый 0,45 Мочевина 1,08 Лактоза 18,0 Агар-агар 18,0
Вода дистилли- рованная, мл 900,0
Эфирные L-аминокислоты, мМ: Аргинин 0,01 Цистин 0,005 Глутамин 0,12 Гистидин 0,005 Изолейцин 0,02 Лейцин 0,02 Лизин 0,02 Метионин 0,005 Фенилаланин 0,01 Треонин 0,02 Триптофан 0,002 Тирозин 0,01 Валин 0,02
Витамины, г: Биотин 0,0001 Холин 0,0001 Фолиевая кислота 0,0001 Никотинамид 0,0001
Пантотеновая кислота 0,0001 Пиридоксал 0,0001 Тиамин 0,0001 Рибофлавин 0,00001 Белок сыворотки, мл 10,0
Минеральные соли, г: Натрий хлористый 0,68 Калий хлористый 0,004
Однозамещенный
кристаллогидрат
фосфорнокислого натрия 0,014
Натрий гидрокар- бонат 0,22 Кальций хлористый 0,02 Магний хлористый 0,008
Смешивающиеся, г: Глюкоза 0,1 Фенол красный 0,0005 Пенициллин 0,005 Стрептомицин 0,005
Вода дистиллиро- ванная, мл 100,0
Изобретение осуществляют следующим образом.

В основу предлагаемой питательной среды берется модифицированная Бенкеном и другими среда Чапека с лактозой и мочевиной. В стерильную среду перед разливом в чашки Петри с целью улучшения качества добавляют жидкую питательную среду Игла, применяемую для культивирования растительных и животных клеток (Eagle Harry. Propagation in a fluid medium of a human epidermoid carcinoma, strain K. B. Proceeding of the society for Experimental Biology and Medicine, 1955, V. 89, 3, 362-364), содержащую:
Эфирные L-аминокислоты, мМ: Аргинин 0,1 Цистин 0,05 Глутамин 1,2 Гистидин 0,05 Изолейцин 0,2 Лейцин 0,2 Лизин 0,2 Метионин 0,05 Фенилаланин 0,1 Треонин 0,2 Триптофан 0,02 Тирозин 0,1 Валин 0,2
Витамины, г: Биотин 0,001 Холин 0,001 Фолиевая кислота 0,001 Никотинамид 0,001 Пантотеновая кислота 0,001 Пиридоксал 0,001 Тиамин 0,001 Рибофлавин 0,0001 Белок сыворотки, мл 100,0
Минеральные соли, г: Натрий хлористый 6,8 Калий хлористый 0,4
Однозамещенный
кристаллогидрат
фосфорнокислого натрия 0,14
Натрий гидрокар- бонат 2,2 Кальций хлористый 0,2 Магний хлористый 0,008
Смешивающиеся, г: Глюкоза 1,0 Фенол красный 0,005 Пенициллин 0,05 Стрептомицин 0,05
Вода дистиллиро- ванная, мл до 1000,0
На жидкой питательной среде Игла спороношение гриба D. teres не получено.

Предварительный анализ выращивания гриба D. teres показал, что применение сред по отдельности не обеспечивает такие свойства, которые они проявляют в предлагаемом изобретении в совокупности, а именно обеспечивают высокую репродуктивную активность выращиваемого на ней гриба без продуцирования воздушного мицелия или с минимальным его количеством. Среда Игла впервые применяется по новому назначению для получения спороношения гриба D. teres.

В процессе приготовления среды компоненты вносят в следующей последовательности.

В половинном объеме дистиллированной воды (450 мл) замачивают на 1 ч 18 г агар-агара, который затем расплавляют в кастрюле на огне. Оставшуюся воду (450 мл) подогревают до 35-40^оС и растворяют в ней раздельно остальные компоненты, г: КН₂РО₄ 0,45; MgSO₄ 0,45; KCl 0,45; мочевина 1,08; лактоза 18. После полного растворения ингредиентов их сливают в одну колбу, фильтруют через слой марли и соединяют с расплавленным, предварительно профильтрованным через 2 слоя марли, агар-агаром. Восстанавливают до первоначального объема (900 мл), добавляя дистиллированную воду. Отливают 200 мл среды в химический стакан, ставят на магнитную мешалку и прибором "Орион 720" определяют величину рН, которую доводят до 5,7-5,8. Для уменьшения показателя применяют концентрированную соляную кислоту HCl, для увеличения едкий натр NaOH.

Затем среду разливают в плоскодонные стеклянные колбы по 450 мл и стерилизуют при 0,5 атм в течение 30 мин. После охлаждения до 40-42^оС добавляют асептично стерильным шприцем 100 мл жидкой питательной среды Игла, взбалтывают и разливают в чашки Петри.

В 100 мл среды Игла содержится:
Эфирные L-аминокислоты, мМ: Аргинин 0,01 Цистин 0,005 Глутамин 0,12 Гистидин 0,005 Изолейцин 0,02 Лейцин 0,02 Лизин 0,02 Метионин 0,005 Фенилаланин 0,01 Треонин 0,02 Триптофан 0,002 Тирозин 0,01 Валин 0,02
Витамины, г Биотин 0,0001 Холин 0,0001 Фолиевая кислота 0,0001 Никотинамид 0,0001 Пантотеновая кислота 0,0001 Пиридоксал 0,0001 Тиамин 0,0001 Рибофлавин 0,00001 Белок сыворотки, мл 10,0
Минеральные соли, г: Натрий хлористый 0,68 Калий хлористый 0,04
Однозамещенный
кристаллогидрат
фосфорнокислого натрия 0,014
Натрий гидрокар- бонат 0,22 Кальций хлористый 0,02 Магний хлористый 0,008
Смешивающиеся, г: Глюкоза 0,1 Фенол красный 0,0005 Пенициллин 0,005 Стрептомицин 0,005
Вода дистилли- рованная, мл до 100,0
Полученную смесь взбалтывают и разливают по 15 мл в чашки Петри возле пламени горелки.

Посевной материал изолят К-268 генетически однородная клоновая культура гриба D. teres Северо-Казахстанской популяции. Изолят выращивают на модифицированной Бенкеном и другими среде Чапека 10 дн в климатической камере с длиной светового периода 12 ч (21^оС) и темноты (18^оС) при комбинированном освещении: 4 лампы ультрафиолетового света (L 40W/77 Fluora) с пиком спектра в области 365 нм (Leach C.N. 1962, 1967) и 4 флуоресцентные лампы дневного света. Расстояние лампы от инкубируемых чашек Петри с культурой 500 мм. Уровень освещенности 4,8-5,0 клк.

Из полученной культуры гриба вырезают блоки агара (диаметр 9 мм) со спорами и мицелием и помещают по одному в чашку на поверхность испытуемой среды в трех повторностях. Засеянные чашки инкубируют в аналогичных условиях также в течение 10 дн. Для сравнения споруляции изолят гриба одновременно выращивают на нескольких питательных средах: модифицированной Бенкеном и другими среде Чапека; арахисо-овсяной, картофельно-декстрозной, картофельно-сахарозной.

Через 10 сут инкубации проводят подсчет спор. Для этого культуру гриба измельчают в 50 мл стерильной дистиллированной воды в гомогенизаторе РТ-1 в течение 5 мин (1 мин при 3000 об/мин и 4 мин при 5000 об/мин). Полученную суспензию фильтруют через один слой марли и раскапывают 0,01 мл на предметное стекло в трех повторностях. Подсчет спор проводят с помощью микроскопа (при малом увеличении) или под стереоскопической бинокулярной лупой. Средний показатель количества спор получают путем деления суммы показателей трех повторностей.

Для проведения сравнительной оценки было приготовлено 5 вариантов питательной среды, состав которых приводится в табл.2.

Концентрации минеральных солей среды-прототипа пересчитывают в зависимости от количества добавляемой среды Игла. На 970,0; 950,0; 900,0; 850,0; 800,0 мл среды-прототипа добавляют соответственно 30,0; 50,0; 100,0; 150,0; 200,0 мл среды Игла.

Оптимальное соотношение компонентов среды, при котором достигается наилучший результат обильное спороношение гриба D. teres, получен при внесении 100,0 мл среды Игла в 900,0 мл среды-прототипа.

Для оценки эффективности предлагаемой среды проводят ее сравнительные испытания с известной модифицированной Бенкеном и другими средой Чапека (табл.3).

П р и м е р 1. Готовят питательную среду для культивирования гриба D.teres, используя, г:
Калий фосфорно-
кислый однозаме- щенный 0,485 Магний серно- кислый 0,485 Калий хлористый 0,485 Мочевина 1,164 Лактоза 19,4 Агар-агар 19,4
Вода дистилли- рованная, мл 970,0
Разливают по 485 мл в 2 колбы емкостью 1000,0 мл, стерилизуют при 0,5 атм 30 мин. Охлаждают до 40-42^оС и перед разливом вводят 30,0 мл (по 15,0 мл в каждую колбу) дополнительные компоненты:
Эфирные L-аминокислоты, мМ: Аргинин 0,003 Цистин 0,0015 Глутамин 0,036 Гистидин 0,0015 Изолейцин 0,006 Лейцин 0,006 Лизин 0,006 Метионин 0,0015 Фенилаланин 0,003 Треонин 0,006 Триптофан 0,0006 Тирозин 0,003 Валин 0,006
Витамины, г: Биотин 0,00003 Холин 0,00003 Фолиевая кислота 0,00003 Никотинамид 0,00003 Пантотеновая кислота 0,00003 Пиридоксал 0,00003 Тиамин 0,00003 Рибофлавин 0,000003 Белок сыворотки, мл 3,0
Минеральные соли, г: Натрий хлористый 0,2 Калий хлористый 0,012
Однозамещенный
кристаллогидрат
фосфорнокислого натрия 0,004
Натрий гидрокар- бонат 0,07 Кальций хлористый 0,006 Магний хлористый 0,002
Смешивающиеся, г: Глюкоза 0,03 Пенициллин 0,0015 Стрептомицин 0,0015 Фенол красный 0,00015
Вода дистилли- рованная, мл 30,0
Полученную смесь взбалтывают и разливают в чашки Петри из оргстекла по 15,0 мл.

Засев питательной среды в каждой чашке проводят одним блоком (диаметр 9 мм) агара с мицелием и спорами генетически однородной клоновой десятидневной культуры гриба D. teres (изолят К-268), выращенной на среде-прототипе в климатической камере с длиной светового периода 12 ч (21^оС) и темноты (18^оС) при комбинированном освещении: 4 лампы ультрафиолетового и 4 флуоресцентного дневного света. Уровень освещенности 4,8-5 клк.

После посева на предлагаемой среде чашки Петри с инокулюмом оставляют в боксе на 16-17 ч (при комнатной температуре). Затем инкубируют в климатической камере с приведенными выше условиями.

Через 10 сут проводят подсчет спор гриба в каждой чашке с предлагаемой питательной средой, сравнивая с количеством спор, полученным (в трех повторностях) на среде-прототипе (модифицированной Бенкеном и другими среде Чапека), арахисо-овсяной, картофельно-декстрозной и картофельно-сахарозной средах.

Среднее количество продуцированных на средах спор (с 1 см²) составило, тыс.шт: на среде-прототипе 12,4; предлагаемой 44,1; арахисо-овсяной 1,8; картофельно-декстрозной и картофельно-сахарозной средах единичные споры (табл. 3).

Количество спор, полученное на предлагаемой среде, в 3,56 раза больше, чем на среде-прототипе. Кроме того, на предлагаемой среде отсутствует воздушный мицелий, обильно продуцируемый на всех средах, в том числе среде-прототипе.

П р и м е р 2. Условия приготовления среды и культивирования гриба D. teres, как в примере 1. Состав, г:
Калий фосфорно-
кислый однозаме- щенный 0,475 Магний серно- кислый 0,475 Калий хлористый 0,475 Мочевина 1,14 Лактоза 19,0 Агар-агар 19,0
Вода дистилли- рованная, мл 950,0
Дополнительные
компоненты:
Эфирные L-аминокислоты, мМ: Аргинин 0,005 Цистин 0,0025 Глутамин 0,06 Гистидин 0,0025 Изолейцин 0,01 Лейцин 0,01 Лизин 0,01 Метионин 0,025 Фенилаланин 0,005 Треонин 0,01 Триптофан 0,001 Тирозин 0,005 Валин 0,01
Витамины, г: Биотин 0,00005 Холин 0,00005 Фолиевая кислота 0,00005 Никотинамид 0,00005 Пантотеновая кислота 0,00005 Пиридоксал 0,00005 Тиамин 0,00005 Рибофлавин 0,000005 Белок сыворотки, мл 5,0
Минеральные соли, г: Натрий хлористый 0,34 Калий хлористый 0,02 Однозамещенный кристаллогидрат фосфорнокислого натрия 0,007 Натрий гидрокар- бонат 0,11 Кальций хлористый 0,01 Магний хлористый 0,004
Смешивающиеся, г: Глюкоза 0,05 Фенол красный 0,00025 Пенициллин 0,0025 Стрептомицин 0,0025 Вода дистиллиро- ванная, мл 50,0
Среднее количество продуцированных на средах спор (с 1 см²) составило, тыс. шт. на среде-прототипе 12,4; на предлагаемой 53,5; арахисо-овсяной 1,8; картофельно-декстрозной и картофельно-сахарозной средах единичные споры (табл.3).

Количество спор, полученное на предлагаемой среде, в 4,31 раза больше, чем на среде-прототипе. Кроме того, на предлагаемой среде отсутствует воздушный мицелий, обильно продуцируемый на всех средах, в том числе среде-прототипе.

П р и м е р 3. Условия приготовления среды и культивирования гриба D. teres, как в примере 1. Состав, г:
Калий фосфорно-
кислый однозаме- щенный 0,45
Магний серно- кислый 0,45 Калий хлористый 0,45 Мочевина 1,08 Лактоза 18,0 Агар-агар 18,0
Вода дистиллиро- ванная мл 900,0
Дополнительные компоненты:
Эфирные L-аминокислоты, мМ: Аргинин 0,01 Цистин 0,005 Глутамин 0,12 Гистидин 0,005 Изолейцин 0,02 Лейцин 0,02 Лизин 0,02 Метионин 0,005 Фенилаланин 0,01 Треонин 0,02 Триптофан 0,002 Тирозин 0,01 Валин 0,02
Витамины, г: Биотин 0,0001 Холин 0,0001 Фолиевая кислота 0,0001 Никотинамид 0,0001
Пантотеновая кислота 0,0001 Пиридоксал 0,0001 Тиамин 0,0001 Рибофлавин 0,00001 Белок сыворотки, мл 10,0
Минеральные соли, г: Натрий хлористый 0,68 Калий хлористый 0,04
Однозамещенный
кристаллогидрат
фосфорнокислого натрия 0,014
Натрий гидрокар- бонат 0,22 Кальций хлористый 0,02 Магний хлористый 0,008
Смешивающиеся, г: Глюкоза 0,1 Фенол красный 0,0005 Пенициллин 0,005 Стрептомицин 0,005
Вода дистилли- рованная, мл 100,0
Среднее количество продуцированных на средах спор (с 1 см²) составило, тыс.шт. на среде-прототипе 12,4; на предлагаемой среде 91,9; арахисо-овсяной 1,8; картофельно-декстрозной и картофельно-сахарозной средах единичные споры (табл.3).

Количество спор, полученное на предлагаемой среде, в 7,4 раза больше, чем на среде-прототипе. Кроме того, на предлагаемой среде отсутствует воздушный мицелий, обильно продуцируемый грибом на всех средах, в том числе среде-прототипе.

Данное количественное соотношение компонентов в составе среды обеспечивает наибольшее спороношение гриба и является оптимальным.

П р и м е р 4. Условия приготовления среды и культивирования гриба D. teres, как в примере 1. Состав, г:
Калий фосфорно-
кислый однозаме- щенный 0,42 Магний серно- кислый 0,42 Калий хлористый 0,42 Мочевина 1,02 Агар-агар 17,0 Лактоза 17,0
Вода дистиллиро- ванная, мл 850,0
Дополнительные компоненты:
Эфирные L-аминокислоты, мМ: Аргинин 0,015 Цистин 0,0075 Глутамин 0,18 Гистидин 0,075 Изолейцин 0,03 Лейцин 0,03 Лизин 0,03 Метионин 0,03 Фенилаланин 0,015 Треонин 0,03 Триптофан 0,003 Тирозин 0,015 Валин 0,03
Витамины, г: Биотин 0,00015 Холин 0,00015 Фолиевая кислота 0,00015 Никотинамид 0,00015
Пантотеновая кислота 0,00015 Пиридоксал 0,00015 Тиамин 0,00015 Рибофлавин 0,000015 Белок сыворотки, мл 15,0
Минеральные соли, г: Натрий хлористый 1,02 Калий хлористый 0,06
Однозамещенный
кристаллогидрат
фосфорнокислого натрия 0,021
Натрий гидрокар- бонат 0,33 Кальций хлористый 0,03 Магний хлористый 0,012
Смешивающиеся, г: Глюкоза 0,15 Фенол красный 0,00075 Пенициллин 0,0075 Стрептомицин 0,0075
Вода дистиллиро- ванная, мл 150,0
Среднее количество продуцированных на средах спор (с 1 см²) составило, тыс.шт. на среде-прототипе 12,4; на предлагаемой среде 80,7; арахисо-овсяной 1,8; картофельно-декстрозной и картофельно-сахарозной средах единичные споры (табл.3).

Количество спор, полученное на предлагаемой среде, в 6,5 раз больше, чем на среде-прототипе. Кроме того, на предлагаемой среде отсутствует воздушный мицелий, обильно продуцируемый на всех средах, в том числе среде-прототипе.

П р и м е р 5. Условия приготовления среды и культивирования гриба D. teres, как в примере 1. Состав, г:
Калий фосфорно-
кислый однозаме- щенный 0,4
Магний серно- кислый 0,4 Калий хлористый 0,4 Мочевина 0,96 Агар-агар 16,0 Лактоза 16,0
Вода дистиллиро- ванная, мл 800,0
Дополнительные компоненты:
Эфирные L-аминокислоты, мМ: Аргинин 0,02 Цистин 0,01 Глутамин 0,24 Гистидин 0,01 Изолейцин 0,04 Лейцин 0,04 Лизин 0,04 Метионин 0,01 Фенилаланин 0,02 Треонин 0,04 Триптофан 0,004 Тирозин 0,02 Валин 0,04
Витамины, г: Биотин 0,0002 Холин 0,0002 Фолиевая кислота 0,0002 Никотинамид 0,0002 Пантотеновая кислота 0,0002 Пиридоксал 0,0002 Тиамин 0,0002 Рибофлавин 0,00002 Белок сыворотки, мл 20,0
Минеральные соли, г: Натрий хлористый 1,36 Калий хлористый 0,08
Однозамещенный
кристаллогидрат
фосфорнокислого натрия 0,028
Натрий гидрокар- бонат 0,44 Кальций хлористый 0,04 Магний хлористый 0,016
Смешивающиеся, г: Глюкоза 0,2 Фенол красный 0,001 Пенициллин 0,01 Стрептомицин 0,01
Вода дистилли- рованная, мл 200,0
Среднее количество продуцированных на средах спор (с 1 см²) составило, тыс. шт. на среде-прототипе 12,4; на предлагаемой 72,2; арахисо-овсяной 1,8; картофельно-декстрозной и картофельно-сахарозной средах единичные споры (табл.3).

Количество спор, полученное на предлагаемой среде, в 6 раз больше, чем на среде-прототипе. Кроме того, на предлагаемой среде отсутствует воздушный мицелий, обильно продуцируемый на всех средах, в том числе среде-прототипе.

Для сравнения анализируемых примеров предлагаемой среды с прототипом проведен дисперсионный анализ, основанный на критерии Фишера, в предположении, что случайные выборки подчиняются закону нормального распределения, наименьшую существенную разницу (НСР_0,05) средних значений рассчитывали с помощью критерия Тьюки при доверительной вероятности Р 0,95.

Как видно из табл.3, наличие дополнительных компонентов жидкой питательной среды Игла, впервые применяемой для получения спороношения гриба Drechslera teres, в предлагаемой среде резко увеличивает спороношение при введении 30,0; 50,0 мл (44,1-53,5 тыс.шт/см²) и достигает максимума при 100,0 мл (91,9 тыс.шт/см²) (примеры 1-3). Количество спор соответственно в 3,6; 4,3 и 7,4 раза больше, чем на среде-прототипе. При увеличении количества дополнительных компонентов до 150,0; 200,0 (примеры 4-5) спорообразование снижается (80,7 и 72,2 тыс.шт/см²). Количество спор соответственно в 6,5 и 6 раз больше, чем на среде-прототипе.

Оптимальное соотношение компонентов среды, при котором достигается наилучший результат (спороношение в 7,4 раза больше), получен при внесении 100 мл среды Игла в 900 мл среды-прототипа (пример 3). Дальнейшее увеличение количества компонентов нецелесообразно, так как наблюдается снижение спорообразования. Результаты проведенного анализа представлены на фиг.1 (с 1 чашки Петри) и фиг. 2 (с 1 см²). Полученные результаты достоверно различаются во всех примерах по сравнению с прототипом как с 1 чашки Петри, так и с 1 см².

Таким образом, использование среды позволяет повысить репродуктивную активность культивируемого на ней продуцента-гриба Drechslera teres за счет введения дополнительных источников питания аминокислот, витаминов, микроэлементов, белка сыворотки и др. Это дает возможность получить большое количество конидиального инокулюма, более жизнеспособного и агрессивного по сравнению с мицелиальным.

Отсутствие образования воздушного мицелия или минимальное его количество упрощает диагностику патогенов, исследование культурально-морфологических, генотипических и физиологических признаков гриба, облегчает выделение целевого продукта конидий, что позволяет использовать однообразный инокулюм требуемой концентрации во всех вариантах опыта. В результате повышается ценность различных экспериментов, в том числе создания инфекционных фонов, оценки иммунности селекционных сортов к сетчатой пятнистости.

Формула изобретения

СИНТЕТИЧЕСКАЯ ТВЕРДАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ СПОР НЕСОВЕРШЕННОГО ГРИБА DRECHSLERA TERES (SACC ) SHOEM, включающая лактозу, мочевину, калий фосфорнокислый однозамещенный, магний сернокислый, калий хлористый, агар-агар и воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит жидкую питательную среду Игла при следующем соотношении компонентов, г:
Лактоза - 19,40 - 18,00
Мочевина - 1,164 - 1,08
Калий фосфорнокислый однозамещенный - 0,485 - 0,45
Магний сернокислый - 0,485 - 0,45
Калий хлористый - 0,485 - 0,45
Агар-агар - 19,40 - 18,00
Вода, мл - 970,00 - 900,00
Среда Игла, мл - 30,00 - 100,00

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6