Способ получения комплекса биологически активных липидов

 

Использование: биотехнология, микробный синтез фармакологически активных веществ. Сущность изобретения: получение комплекса липидов, содержащих γ -линоленовую кислоту. Способ предусматривает выращивание гриба Mucor lusitanicus ИНМИ при глубинном культивировании в условиях непрерывной аэрации на питательной среде, содержащей углеводородный источник углерода и неорганический источник азота. Среда дополнительно содержит, г/л: ацетат натрия 3 - 5; KMnO₄ 0,015 - 0,030; CuSO₄·7H₂O 0,01 - 0,0001; витамин B 0,002, выращивание ведут при pH 4,5 - 5,5. За 72 ч на 100 г использованной глюкозы синтезируется 12 г липидов, которые содержат 28% γ -линоленовой кислоты от суммы жирных кислот и 6500 мкг каротиноидов на 1 г липидов. 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, а именно к микробному синтезу фармакологически активных веществ.

Известно, что полиненасыщенные жирные кислоты, в частности γ-линоленовая кислота, являются биологически активными вещества и используются в медицине, например, для предупреждения атеросклероза, а также как противовоспалительные, антиаллергические средства . В последнее время липиды, содержащие γ-линоленовую кислоту, находят широкое применение также в косметологии .

Каротиноиды - биологически активные соединения, они входят в состав препаратов, обладающих репаративной активностью .

Наряду с лечебным действием каротиноиды обладают антиоксидантным действием по отношению к ненасыщенным липидам , поэтому присутствие их в липидах стабилизирует полиненасыщенные жирные кислоты, в данном случае предотвращает перекисное окисление γ-линоленовой кислоты.

Представляет большой интерес разработка способа получения липидов, содержащих так γ-линоленовую кислоту, так и каротиноиды.

Известен способ получения липидов, содержащих полиненасыщенные жирные кислоты и каротиноиды, с помощью культуры Mortierella .

Недостатком этого способа является недостаточно высокое содержание γ-линоленовой кислоты и каротиноидов в липидах (в 8% γ-линоленовой кислоты от суммы жирных кислот и 1800 мкг/г липидов каротиноидов).

Известен способ получения каротиноидов с помощью культуры Вl.trispora, его липиды содержат 20000 мкг/г липидов каротиноидов, но всего лишь до 12% γ-линоленовой кислоты от суммы жирных кислот .

Известен способ получения комплекса биологически активных веществ липидной природы с помощью штамма дрожжей Rhodotorula glutinis . В комплексе липидов содержится до 40% незаменимых жирных кислот от суммы жирных кислот и 1200-1250 мкг каротиноидов на 1 г липидов. Однако в составе жирных кислот отсутствует γ -линоленовая кислота. Данный комплекс липидов предлагается использовать в сельском хозяйстве качестве добавки в корм животных.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению является способ получения биологически активных липидов, содержащих γ-линоленовую кислоту, с помощью гриба Мuсor ИНМИ . Культуру гриба выращивают в течение 72 ч при температуре 28±1 ^оС в двухлитровых колбах с рабочим объемом 300 мл. Состав среды, г/л Н₂О: глюкоза 30; мочевина 1 г; К₂НРО₄1 г; NaCl 0,5 г; MgSO₄ ˙7H₂O 0,5 г; FeSO₄ ˙7Н₂О 0,01 г; СаСl₂ 0,02 г; ZnSO₄ ˙7H₂O 0,01 г; дрожжевой экстракт 0,5; витамин В₆ 2 мг; биотин 0,02 мг; Н₂О 1 л, рН 6,5, при аэрации 1,6-1,8 О₂/л/ч. При этом получают 29% γ-линоленовой кислоты от суммы жирных кислот при выходе липидов 12,0 г на 100 г использованной глюкозы, каротиноидов 1500-2000 мкг/г липидов.

Недостатком данного способа является низкое содержание каротиноидов в липидах, в результате чего они недостаточно эффективны при изготовлении ранозаживляющих и других лекарственных средств.

Цель изобретения - увеличение содержания каротиноидов в комплексе липидов, содержащих γ-линоленовую кислоту.

Это достигается тем, что гриб Mucor lusitanicus ИНМИ (депонирован в ВКМ под номером F - 306 Д) выращивают на среде следующего состава, г/л Н₂О): глюкоза 60±0,01; ацетат натрия 3-5; мочевина 2±0,01; К₂ НРО₄ 1 ± 0,01; NаСl 0,5±0,01; MgSO₄ ˙ 7H₂O 0,5 ± 0,01; ZnSO₄ ˙ 7H₂O 0,01± 0,001; FeSO₄ ˙ 7H₂O 0,01 ± 0,001; СuSO₄ ˙7Н₂О 0,01±0,001; СаСl₂ 0,02±0,001; KMnO₄ 0,015-0,030; витамин В₁ 0,002; витамин В₆ 0,002; биотин 0,02 мг; дрожжевой экстракт 0,5±0,01. Культивирование проводят в течение 72 ч при температуре 26-28^оС, аэрации 1,6-1,8 О₂/л/ч, рН 4,5-5,5.

Мицелий отделяют от культуральной жидкости фильтрованием и лиофилизируют. Липиды извлекают из лиофилизированной биомассы последовательной экстракцией этанолом и гексанолом (соотношение биомассы и растворителя 1:15). Жирнокислотный состав липидов определяют методом газожидкостной хроматографии метиловых эфиров жирных кислот, которые получают кислотным метанолизом. Каротиноиды определяют спектрофотометрически при длине волны 451±2 нм.

В результате получают смесь липидов, содержащую 28-30% γ-линоленовой кислоты от суммы жирных кислот и 5600-6500 мкг/г липидов каротиноидов, при выходе липидов 11-12 г на 100 г использованной глюкозы.

Отличительным признаком данного способа является то, что среда дополнительно содержит, г/л: ацетат натрия 3-5; КМnО₄ 0,015-0,03; СuSO₄˙7H₂O 0,01± 0,001; витамин В₁ 0,002, а выращивание ведут при рН 4,5-5,5.

Добавление КМnО₄, являющегося сильным окислителем, стимулирует синтез каротиноидов, не оказывая влияния на рост гриба и не подавляя синтез γ-линоленовой кислоты. Добавление ацетата натрия в концентрации от 3 до 5 г/л и витамина В₁ способствует синтезу липидов и каротиноидов. При повышении концентрации ацетата натрия больше 5 г/л снижается содержание γ-линоленовой кислоты в липидах. СuSO₄ x x 7Н₂О стимулирует синтез γ-линоленовой кислоты.

П р и м е р 1. Культуру Мucor lusitanicus ИНМИ выращивают в течение 72 ч в колбах на 750 мл, содержащих 100 мл среды, при температуре 28^оС на качалке при аэрации 1,8 О₂/л/ч. Состав среды, г/л Н₂О: глюкоза 60,0; ацетат натрия 3,0; мочевина 2,0; NaCl 0,5; К₂НРО₄ 1,0; MgSO₄ ˙7Н₂О 0,5; ZnSO₄ x 7H₂O 0,01; FeSО₄ ˙7Н₂О 0,01; СаСl₂ 0,02; КМnО₄ 0,015; CuSO₄ ˙ 7H₂O 0,01; витамин В₁ 0,002; витамин В₆ 0,002; биотин 0,02 мг; дрожжевой экстракт 0,5; рН среды 5,5.

В качестве инокулята используют суспензию спор плотностью 10⁶кл/мл. Споровый материал выращивают на агаризо- ванной среде Чапека.

Биомассу отделяют от культуральной жидкости, лиофилизируют. Лиофилизированную биомассу последовательно экстрагируют этанолом и гексаном. Выход липидов составляет 11 г на 100 г использованной глюкозы, при этом содержание γ-линоленовой кислоты - 30% от суммы жирных кислот, каротиноидов - 5600 мкг/г липидов.

П р и м е р 2. Культуру Mucor lusitanicus ИНМИ выращивают в течение 72 ч при температуре 26^оС, аэрации 1,8 О₂/л/ч, на среде следующего состава, г/л Н₂О: глюкоза 60,0; ацетат натрия 5,0; мочевина 2,0; NaCl 0,5; К₂НРО₄ 1,0; МgSО₄ ˙7Н₂О 0,5; ZnSО₄ ˙7Н₂О 0,1; СuSO₄ ˙7Н₂О 0,01; FeSO₄ ˙7H₂O 0,01; CaCl₂ 0,02; КMnO₄ 0,03; витамин В1 0,002; витамин В₆0,002; биотин 0,02 мг; дрожжевой экстракт 0,5, рН среды 4,0.

В качестве инокулята используют суспензию спор плотностью 10⁶кл/мл. Споровый материал выращивают на агаризо- ванной среде Чапека.

Биомассу отделяют от культуральной жидкости, лиофилизируют. Лиофилизированную биомассу последовательно экстрагируют этанолом и гексаном. Выход липидов составляет 12,0 г на 100 г использованной глюкозы, γ-линоленовой кислоты - 28% от суммы жирных кислот, каротиноидов - 6500 мкг/г липидов.

Были изучены ранозаживляющие и противоожоговые свойства комплекса липидов гриба Mucor lusitanicus ИНМИ, полученного данным способом, который содержит γ-линоленовую кислоту и каротиноиды. Исследования проводились на кафедре оперативной хирургии 1-го лечебного факультета Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова. Обнаружено, что присутствие в липидах каротиноидов в значительной степени усиливает лечебное действие используемых липидов (таблица). Как видно из таблицы комплекс липидов, содержащий γ-линолевую кислоту и каротиноиды, обладает более эффективным ранозаживляющим действием, чем липиды с γ-линоленовой кислотой без каротиноидов, облепиховое масло, синтомициновая эмульсия и препарат "Биополиен", разработанный в ММА им. И.М.Сеченова.

Предполагается разработка лабораторного регламента на получение лекарственных форм для наружного применения на основе липидов, полученных предложенным способом, на кафедре заводской технологии ГЛС ММА им. И.И.Сеченова.

Формула изобретения

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КОМПЛЕКСА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ЛИПИДОВ, содержащих γ -линоленовую кислоту и каротиноиды, предусматривающий выращивание гриба Mucor lusitanicus BKMF-306 D на синтетической питательной среде, содержащей источники азота, углерода, фосфора, микроэлементы и витамины, при аэрации, отличающийся тем, что, с целью увеличения содержания каротиноидов в комплексе липидов, используют среду, дополнительно содержащую, г/л: Ацетат натрия 3 - 5 КМпО₄ 0,015 - 0,03 CuSO₄ · 7 H₂O 0,01 ± 0,001 Витамин B₁ 0,002, а выращивание ведут при pH 4,5 - 5,5.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2