Консорциум бактерий (lactobacillus salivarius var.salivarius, streptococcus thermophilus, streptococcus bovis) для активации прорастания семян

 

Использование: сельскохозяйственная микробиология и биотехнология. Сущность изобретения: консорциум молочнокислых бактерий (Lactobacillus salivarius var. salivarius, streptococcus thermophilus, streptococcus bovis) 3844 выделен из образца почвы и предназначен для активации прорастания семян, депонирован во всесоюзной коллекции микроорганизмов под N В-5974. Для получения препарата консорциум засевают в обезжиренное молоко, культивируют при 40^oС в течение 12 ч. Полученную культуру с титром 2,0 млрд/мл, содержащую 10 г/л молочной кислоты и имеющую активность по биотесту на цитокинины 150%, используют для приготовления препарата для активации прорастания семян.

Изобретение относится к сельскохозяйственной микробиологии и биотехнологии, в частности к получению бактериальных препаратов, применяемых в растениеводстве и касается консорциума бактерий для получения вышеуказанных препаратов.

Известно, что при бактеризации семян растений молочнокислыми бактериями, приспособленными к ризосфере, они в ней размножаются, а также содействуют увеличению титра других бактерий, которые используют молочную кислоту. Кроме того, размножаясь в ризосфере, молочнокислые бактерии способствуют растению в усвоении фосфора.

Целью настоящего изобретения является получение консорциума молочнокислых бактерий 3844 (Lactobacillus salivarius var. salivarius, Streptococcus thermophilus, Streptococcus bovis) продуцента препарата для активации прорастания семян.

Предлагаемый консорциум не содержит наиболее часто встречающихся молочнокислых бактерий ризосферы и состоит из культур, активно образующих молочную кислоту и цитокинины. Например, бактеризация семян предлагаемым консорциумом повышает энергию прорастания семян и увеличивает их всхожесть.

Консорциум выделен из образцов почвы, взятых на территории, прилегающей к молокозаводу (Фергана, Узбекистан) с целью получить молочнокислые бактерии, являющиеся активными продуцентами цитокининов и молочной кислоты. Для выделения консорциума применяли прямой высев из образцов почвы, накопительные культуры на жидких средах со спиртом, последующий высев на агаризованные среды с мелом. Затем производили отбор по термофильности, высокой продуктивности молочной кислоты и цитокининов (биотест на цитокинины).

При определении таксономического состава консорциума микроскопирование глубинных колоний позволяет определить соотношение а) молочнокислых стрептококков, б) молочнокислых палочек в исследуемом пассаже консорциума. Колонии молочнокислых стрептококков в виде плотных правильных дисков. Колонии молочнокислых палочек звездчатые, с выростами по периферии и плотным центром. Для получения глубинных колоний с характерной структурой роста в чашки Петри с 2-х суточной культурой консорциума (до 100 колоний на чашке) заливают cлой питательной среды, расплавленной и охлажденной до 45^оС и культивируют еще 48 ч.

Доминирующим компонентом консорциума являются палочки 65-75% стрептококки составляют 25-35% Варьирование компонентов консорциума может зависеть от состава питательной среды. При резком увеличении процента углеводов в среде и одновременном снижении содержания азотистых веществ количество стрептококков в жидкой культуре возрастает до 90-95% Культивирование консорциума на постоянной регламентной среде (10%-ное обезжиренное молоко) обеспечивает 65-75% палочек и 25-35% стрептококков без утраты функциональной целостности консорциума.

Одной из причин неделимости консорциума является защита культур от бактериофагов. Избирательность бактериофагов и малая вероятность попадания в культуру консорциума одновременно разных фагов, специфичных ко всем составляющим консорциум культурам, дает гарантию развития молочной кислоты до предела, при котором не могут существовать бактериофаги. Кроме того, более энергичное развитие одних культур обеспечивает быстрое накопление молочной кислоты до указанного предела, таким образом медленно растущие молочнокислые бактерии оказываются под надежной защитой.

Высев моноколониальных изолятов консорциума на обезжиренное молоко и изучение их кислотообразующей активности, способности сбраживать углеводы и других физиологобиохимических свойств дает возможность определить видовой состав консорциума.

Streptococcus thermophilus растут при 50^оС, не растут при 10, 13 и 16^оС. Сбраживают мальтозу, раффинозу. Не сбраживают арабинозу, ксилозу, некоторые штаммы не сбраживают маннит и сорбит; предпочтительное использование сахарозы и лактозы перед глюкозой.

Streptococcus bovis слабый и медленный рост при 50^оС, при 10, 13 и 16^оС не растут. Сбраживают мальтозу, раффинозу, инулин, не всегда маннит и сорбит; глюкозу сбраживают интенсивнее, чем лактозу и сахарозу.

Lactobacillus salivarius var. salivarius растут при 50^оС, обычно не растут при 20^оС и никогда не растут при 15^оС. Сбраживают рамнозу, галактозу, лактозу, мальтозу, маннит, мелибиозу, сорбит, сахарозу, раффинозу, трегалозу. Не сбраживают салицин.

Подобный консорциум не описан в литературе и выделен впервые.

Консорциум принят на депонирование в Центральный музей промышленных микроорганизмов ВНИИгенетика под номером В-5974.

Физиологической особенностью консорциума, в целом, имеющей практическое значение, является продуцирование биологически активных веществ. Все культуры, составляющие консорциум, термофилы, температурные границы хорошего роста и высокой активности 30-45^оС, оптимум 38-40^оС. Брожение гомоферментативное.

По морфологии бактерии консорциума представляют собой палочки и кокки. Палочки часто образуют цепочки, особенно в поздней логарифмической фазе роста. Неподвижны, неспорообразующие, грамположительные, становятся грамотрицательными с возрастом и при повышенной кислотности. Кокки клетки сферические или овальные, одиночные, в парах или цепочках. Неподвижные, неспорообразующие, грамположительные.

Культуру выращивают на питательной среде следующего состава, Сухое обезжиренное молоко 10,0 Вода До 100,0 Исходное значение рН среды естественное.

Культуру консорциума выращивают в течение 8-12 ч до рН 3,8-4,0.

Жидкую культуру с титром живых клеток от 2,0 млрд/мл дол 5,0 млрд/мл, содержанием молочной кислоты от 10 до 12 г/л и активностью по биотесту на цитокинины (на проростках редиса) от 130 до 150% используют для приготовления препарата, применяемого в растениеводстве для активации прорастания семян.

Культура консорциума сохраняется в лиофилизированном виде в ампулах.

Перед высушиванием в жидкую культуру в качестве защитной среды добавляют сахарозо-желатиновую смесь (4% желатины, 40% сахарозы, вода) в количестве 75% к объему жидкой культуры и разливают по 2 мл в ампулу.

Срок хранения сухой культуры до 2-х лет при температуре (-4)-(+4)^оС.

П р и м е р 1. При производственном культивировании для получения посевной культуры 1 ампулу сухого материала консорциума засевали в 100 мл обезжиренного 10%-ного молока.

Выращенной посевной культурой 1 пассажа в количестве 10% засевали колбы с 400 мл питательной среды для получения посевной культуры 2 пассажа.

Культивирование посевной культуры консорциума молочнокислых бактерий 1 и 2 пассажей вели при 40^оС в течение 12 ч. рН выращенного посевного материала 1 и 2 пассажей 3,8.

Посевной материал 2 пассажа использовали для приготовления инокулята (10% к объему питательной среды). Культивирование в инокуляторе вели при 40^оС в течение 12 ч. Значение рН в конце ферментации 3,8.

Культивирование в ферментере вели при температуре 40^оС в течение 10 часов на 10%-ном обезжиренном молоке. Значение рН в конце ферментации 4,0.

Полученную жидкую культуру с титром 2,0 млрд/мл, содержанием молочной кислоты 10 г/л и активностью по биотесту (на проростках редиса) 150,0% использовали для приготовления препарата.

П р и м е р 2. Для приготовления 2,0 л препарата компоненты смешивали в следующем соотношении: сухие водоросли Fucus 12,0 г; мочевина 12,0 г; культура консорциума 3844, полученная в примере 1 600,0 мл; натрий бензоат 5,0 г; кальций пропионат 5,0 г; аскорбиновая кислота 5,4 г; комплексонаты (смесь) 2,0 г; вода до 2000,0 мл.

Для приготовления препарата использовали смесь следующих комплексонатов в равных весовых соотношениях: K₂ZnОЭДФ, NH₄-FeOЭДФ, Мо-ОЭДФ, К₂СоОЭДФ, К₂MgОЭДФ, К₂MnОЭДФ.

Сухие водоросли предварительно замачивали в небольшом количестве воды.

После внесения мочевины кислотность смеси доводили до значения рН 5,0.

рН готового препарата 4,4.

Активность по биотесту на цитокинины (на проростках редиса) 150,0% Полученным препаратом обрабатывали картофель, сорт "Невский", из расчета 1 л на гектарную норму посевного материала.

Урожай повысился на 36,0% по сравнению с контролем (контроль не обработанный картофель). Выход стандаpтной продукции 98,0% (в контроле 81,0%).

Формула изобретения

Консорциум бактерий (Lactobacillus salivarius var. salivarius, streptococcus thermophilus, streptocossus bovis) ВКПМ В-5974 для активации прорастания семян.