Способ очистки суспензии спорозоитов эймерий от примесей

 

Использование: дифференциальное разделение частиц разного размера и формы, протозоология, очистка спорозоитов паразитических простейших эймерий от ооцист. Сущность изобретения: очистка спорозоитов от примесей проводят путем непринудительной фильтрации суспензии через слой коллагеновых микроносителей (высота слоя - 1,5-2,0 см). Двукратная фильтрация сохраняет 89% первоначального количества спорозоитов при степени очистки 96%. Для очистки спорозоитов используют микроносители с диаметром 150-200 мкм, откалиброванные на сите с соответствующим диаметром ячеек, полученных из недубленных коллагенсодержащих отходов кожевенного производства. Изобретение позволяет достичь высокой степени очистки и сохранности первоначального количества спорозоитов эймерий, а также снизить себестоимость процесса очистки за счет применения дешевых коллагеновых микроносителей. 2 з. п. ф-лы.

Изобретение относится к дифференциальному разделению частиц разного размера и формы, находящихся в жидкости, применительно к разделу биологии протозоологии, в частности к проблеме очистки спорозоитов паразитических простейших эймерий от ооцист, спороцист и их обломков, полученных при механическом разрушении ооцист и ферментативном выделении спорозоитов из спороцист.

Известно несколько принципиально отличающихся друг от друга способов очистки спорозоитов эймерий от указанных примесей. При любом способе важными являются два параметра: степень очистки спорозоитов в окончательной суспензии и сохранность исходного количества спорозоитов. Так, при фильтрации суспензии спорозоитов эймерий через синтетические волокна "Leuko-Pak" степень очистки составляет 75% при сохранности 85-95% спорозоитов [1] Метод элютриационного центрифугирования дает возможность получить очень чистую, практически без примесей, суспензию спорозоитов эймерий, но с потерей 50% первоначального их количества [2] При двукратной очистке спорозоитов эймерий в градиенте перколла различной плотности, сначала после механического разрушения ооцист для получения чистой суспензии спороцист, а затем для очистки спорозоитов от примеси неразрушенных спороцист и их обломков, получают 99% степень очистки при сохранности только 39% первоначального количества спорозоитов.

Непосредственным прототипом предлагаемого способа является очистка спорозоитов эймерий на колонке со стеклянными шариками (диаметр шариков 200 мкм, диаметр колонки 2,5 см, высота слоя шариков 10 см) [4] Суспензию спорозоитов наносили на колонку и промывали забуференным раствором Рингера (рН 8,0). При этом большинство спорозоитов, имеющих удлиненную банановидную форму, легко проходило через колонку, а интактные ооцисты и спороцисты большего размера яйцевидной формы, а также их обломки неправильной формы задерживались в слое шариков. Степень очистки составляла (91 ± 6)% при сохранности спорозоитов (86 ± 10)% Основными контаминантами были спороцисты.

Целью изобретения является получение более высокой степени очистки и сохранности первоначального количества спорозоитов эймерий, а также снижение себестоимости процесса очистки за счет применения дешевых, доступных отечественных материалов, так как ни синтетические волокна, ни перколл, ни стеклянные шарики указанного размера не производятся в нашей стране.

Поставленная цель достигается тем, что для очистки спорозоитов эймерий вместо стеклянных шариков применяются коллагеновые микроносители сходного диаметра 150-200 мкм. В качестве исходного сырья для получения коллагеновых гранул используют недубленные коллагенсодержащие отходы кожевенного производства, которые подвергают щелочно-солевой обработке, нейтрализации и промывке до получения нейтральной коллагеновой массы, которую затем концентрируют до содержания белка в данном продукте 10-15% нагревают до 27-31^оС и выпрыскивают под давлением через металлическое сопло диаметром 0,3-0,5 мм в масло, перемешивая образующуюся двухфазную смесь за счет акустических мелкомасштабных вихрей, создаваемых низкочастотным ультразвуковым воздействием.

Струю коллагеновой массы электризуют, для чего на корпус металлического сопла подают электрический потенциал того или иного знака. В результате струя легко распадается на сферические микрокапли одинакового заряда размером 100-300 мкм, которые благодаря одноименному электрическому заряду взаимно отталкиваются и не образуют более крупных частиц. Взаимные отталкивания коллагеновых молекул внутри каждой микрокапли приводят к формированию пористой структуры, за счет чего существенно увеличивается эффективная поверхность, к которой могут прикрепляться клетки, молекулы ферментов и других веществ, требующих иммобилизации.

После инжектирования коллагеновой массы в масло и перемешивания смесь охлаждают до 4^оС, образовавшиеся гранулы обезжиривают бутанолом, задубливают глутаровым альдегидом, а затем активированную глутаром поверхность гранул покрывают коллагеном, инкубируя частицы в растворе 0,5-0,8% коллагена с рН 5,2-5,4 в течение 3-4 ч при 25-27^оС. После этого частицы микроносителя подвергают серии последовательных обработок с целью отмывки от несвязавшегося коллагена, блокировки свободных альдегидных групп на поверхности гранул, а затем автоклавируют, после чего он пригоден для использования.

Для очистки спорозоитов эймерий используют микроносители с диаметром 150-200 мкм, откалиброванные на сите с соответствующим диаметром ячеек.

Очистку спорозоитов проводят в три этапа. Для первичной очистки, в основном от ооцист, суспензию, состоящую из спорозоитов, неразрушенных ооцист, спороцист и их обломков, пропускают через фильтр из синтетического волокна (фторин) (производства ЛенНИИХимВолокно), помещенного на дне стеклянной колонки (диаметр колонки 1,5-2,0 см). Суспензию фильтруют без применения дополнительного давления. Полученный фильтрат наносят на стеклянную колонку такого же диаметра, заполненную коллагеновыми микроносителями (высота слоя микроносителей 1,5-2,0 см). При заполнении колонки микроносителями используют подложку из двух слоев марли. Микроносители, хранившиеся в забуференном физиологическом растворе (рН 7,2), после заполнения ими колонки промывают трис-НСl буфером (рН 7,8). Суспензию спорозоитов с примесями в трисНСl буфере в концентрации 1 ˙ 10⁷ спорозоитов на 1 мл пропускают без применения дополнительного давления через слой микроносителей, после чего колонку промывают 5-7 мл буфера. В результате однократной фильтрации очищенность спорозоитов возрастает с (44,6 ± 3,5)% до (64,9 ± 3,4)% при потере 3,7% первоначально выделенных спорозоитов. При повторной фильтрации через такую же, но обязательно новую колонку с микроносителями, сохраняется (89,1 ± 7,6)% исходного количества спорозоитов при степени очистки (96,2 ± 1,9)% Очистка спорозоитов эймерий от примесей на колонке с коллагеновыми микроносителями, по-видимому, за счет большей адгезивности микроносителей, обусловленной их пористой структурой, повышает по сравнению с прототипом степень очистки на 5% Дополнительным преимуществом данного способа очистки спорозоитов является доступность коллагеновых микроносителей и снижение себестоимости фильтрации за счет применения дешевых микроносителей, полученных из недубленных коллагенсодержащих отходов кожевенного производства.

Формула изобретения

1. СПОСОБ ОЧИСТКИ СУСПЕНЗИИ СПОРОЗОИТОВ ЭЙМЕРИЙ ОТ ПРИМЕСЕЙ, включающий непринудительную фильтрацию суспензии через фильтрующую колонку, заполненную фильтрующим материалом, отличающийся тем, что в качестве фильтрующего материала используют коллагеновые микрогранулы, которые получают из коллагеновой массы с содержанием нативного белка 10 20% которую диспергируют в масло или маслосодержащую эмульсию при 27 31^oС, при этом в процессе диспергирования микрогранулам сообщают электрический заряд, а в масле или маслосодержащей эмульсии возбуждают колебания ультразвуковой частоты, после чего коллагеновые микрогранулы обезжиривают и иммобилизуют белок на поверхности микрогранул в растворе коллагена с содержанием белка 0,4 0,8% при pH 4,8 5,4, затем проводят отмывку от несвязывающегося белка.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что используют коллагеновые микрогранулы с диаметром 150 200 мкм.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что высота слоя микрогранул в фильтрующей колонке равна 1,5 2,0 см.