Способ получения сорбентов

 

Использование: в области хроматографии для разделения биологически активных веществ (БАВ). Сущность: способ получения сорбентов, содержащих фосфогруппы, включает обработку гидроксилсодержащих матриц, предварительно обработанных эпихлоргидрином в пристуствии щелочи, (рН больше 12). Процесс фосфорилирования проводят POC₁₃ или Na₂HPO₄ при температуре не более 50^oС. Полученные сорбенты сочетают высокие гидродинамические характеристики с более эффективными эксплуатационными характеристиками. 2 з. п. ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к хроматографии, точнее к способам получения сорбентов, содержащих фосфогруппы, для разделения биологически активных веществ (БАВ).

Фосфокатиониты достаточно широко и эффективно используются для выделения и очистки различных БАВ [1] Недостатком их являются, как правило, низкие гидродинамические характеристики.

Прототипом изобретения является способ получения фосфоцеллюлозы [2] заключающийся в диспергировании сухого порошка целлюлозы в сухом пиридине с последующей обработкой POCl₃ при температуре 115^оС.

Недостатками способа являются: получение сорбента в виде рыхлого порошка; проведение реакции фосфорилирования в кипящем пиридине, что приводит к деструкции матрицы и изменению ее состава за счет обогащения более низкомолекулярными фракциями; обработанная таким образом матрица содержит фосфогруппы различной ионной силы и различной химической породы, т.к. образуются не только моно-, но и ди- и трифосфоэфирные группы, что снижает хроматографическое качество сорбента.

Применение сорбента в виде порошка или частиц неправильной формы затрудняет процесс хроматографии, т.к. происходит засорение фильтров колонок и усадка слоя сорбента, что требует их частой перенабивки, кроме того практически исключает возможность масштабирования процессов хроматографии.

Задачей изобретения является упрощение технологии фосфорилирования с одновременным получением сорбентов в виде сферических гранул с целью улучшения их механических и гидродинамических характеристик.

Поставленная задача решается введением предварительной обработки матрицы, полученной в виде сферических гранул, эпихлоргидрином в присутствии щелочи с рН > 12 с последующей обработкой фосфорилирующими агентами при температуре не более 50^оС.

Технический уровень заявляемого изобретения обуславливается тем, что авторами было установлено, что в случае обработки гидроксилсодержащей матрицы эпихлоргидрином происходит стабилизация структуры матрицы и активация ее реакционной способности. Это позволяет проводить реакцию фосфорилирования в мягких условиях, получать гранулы сорбента в его метрических (микросферических) размерах при сохранении его эксплуатационных характеристик.

Сочетание процессов гранулирования с поперечной сшивкой эпихлоргидрином и эпоксидирование с последующим фосфорилированием таких полимеров в литературе не описано.

В результате при использовании предварительно гранулированных матриц (3, 4) предлагаемый способ получения сферических фосфосорбентов для хроматографии биопрепаратов позволяет создать хроматографический материал повышенного качества: сорбенты не только имеют форму сферических гранул, но и: содержат только химически эквивалентные фосфомоноэфирные группы что исключает дополнительные неспецифические взаимодействия матриц сорбентов с биополимерами, снижающие эффективность хроматографии; имеют крупные поры, что позволяет проводить одновременно гельфильтрацию биополимеров; обладают повышенными гидродинамическими характеристиками; позволяют проводить процессы очистки биопрепаратов с высокой эффективностью.

П р и м е р 1 (прототип). 100 г сухой целлюлозы суспендировали в 1 л сухого пиридина, вводили 170,0 мл (285 г) РОCl₃, кипятили в течение трех часов (t 115^oC). Смесь отфильтровывали, и осадок трижды промывали пиридином. Осадок гидролизовали колотым льдом, фильтровали, промывали водой, 4 раза 1% -ным NaOH, отмывали водой остатки щелочи, 4 раза промывали 5%-ным HCl с последующей обработкой водой до нейтральной рН, сушили. Процент моно-, ди- и трифосфатов 70, 20 и 10 соответственно.

П р и м е р 2.

2.1. 100 мл сферически гранулированной целлюлозы, полученной по способу [3] поместили в колбу с мешалкой, добавили смесь 65 мл 0,5 М раствора NaOH с 3 мл эпихлоргидрина и перемешивали в течение 1 ч при t 60^oC. Затем температуру повысили до 95^оС и перемешивали еще в течение 1 ч. Охладили до комнатной температуры и промыли гранулы до нейтральной реакции водой на фильтре. Предел эксклюзии сорбента по декстранам (метод ГПХ) составляет 4·10⁷ д. Плотность по D-глюкозным звеньям от 0,2 до 1,0 мг·экв/мл, размер гранул 80-120 мкм.

2.2. 100 мл гранул целлюлозы (по 2.1) поместили в емкость с фильтром, промыли последовательно двумя объемами ацетона (или спирта), затем хлороформа (или толуола) и ввели 9,5 мл POCl₃, затем добавили 10 мл сухого пиридина или триэтиламина. Смесь оставили на 1 ч при температуре 25-30^о. Матрицу промыли последовательно хлороформом, диоксаном, затем 50%-ным водным пиридином, 1%-ным водным NaOH и водой до нейтральной рН.

П р и м е р 3. 1 л нейтрального геля (Биохром-Н), полученного по способу [4] и подготовленного по примеру 2.1, суспендировали в 0,5 л воды при t 45-50^oC, при перемешивании вводили 0,1-0,15 л эпихлоргидрина и 0,1 л 10-15 М водного раствора NaOH в течение 2-3 ч, фильтровали, матрицу промывали водой до нейтрального рН.

1 л подготовленной матрицы выдерживали в 1 л 0,5-1,0N раствора Na₂HPO₄ в течение 6-8 ч при температуре 40-50^оС. Результаты сведены в табл. 1.

П р и м е р 4. 100 мл нейтрального геля (Биохром-Н 1000), полученного по способу [4] и подготовленного по способу 2.1, поместили в стеклянную емкость с пористым фильтром, промыли последовательно двумя объемами ацетона (или этанола), толуола (или хлороформа) и ввели 9,5 мл POCl₃, затем 10 мл безводного пиридина или триэтиламина. Смесь оставили на 1 ч при температуре 25-30^оС. Далее матрицу промыли последовательно по два объема соответственно хлороформом, диоксаном, 50% -ным водным раствором пиридина, 1%-ным водным раствором NaOH и водой до нейтрального рН. Свойства сорбента аналогичны представленным в табл. 2.

П р и м е р 5. 100 мл сферически гранулированной целлюлозы, полученной по способу [3] и подготовленной для модификации по примеру 2.1, суспендировали в 50 мл воды при температуре 50-60^о и при перемешивании вводили 10-15 мл эпихлоргидрина и 10 мл 15 мл водного раствора NaOH в течение 2-3 ч. Матрицу промывали на фильтре водой до нейтрального рН, выдерживали в 100 мл 0,5-1,0 н. раствора Na₂HPO₄ в течение 6-8 ч при температуре 40-50^оС, промывали водой до нейтральной рН.

Свойства опытов приведены в табл. 2.

Размер гранул в ходе реакции не изменился. Полученные таким образом сорбенты содержат только монофосфоэфирные группы.

Физико-химические характеристики сорбентов в сравнении с прототипом и аналогом (фосфокатинит Р-11 фирмы Ватман, Англия) сопоставляли, пропуская через колонку 10 х 100 мм 0,1 н. раствор NaCl при давлении, равном 1 (в см водяного столба (см высоты колонки).

Эффективность сорбентов испытывали в процессе очистки лактадегидрогеназы (аналог Р-11) и инсулина.

П р и м е р 6. На колонку 10 х 100 мм наносили раствор смеси белков, содержащий лактодегидрогеназу 2 мл в 0,03 н. Na-фосфатном буфере (рН 7,5) при скорости потока 20 мл/ч. Колонку промывали тем же буфером, v 15 мл, элюировали белки в линейном градиенте 0-0,5 н. NaCl в том же буфере. Фракции по 4,4 мл собирали и определяли содержание белка и активность фермента. Результаты сведены в табл. 3.

П р и м е р 7. Хроматографическая очистка реакционной смеси после ферментативного превращения проинсулина и инсулин на колонке, заполненной сорбентом фосфо-Биохром.

Реакционную смесь объемом 2,3 л, содержащую 3 л фосфо-Биохром и уравновешенную исходным буфером, 50 мМ ацетат натрия рН 4,0 и 3,5 М мочевины. После нанесения смеси колонку промывали 7,2 л исходного буфера (2 ч) со скоростью протока 3,6 л/ч. При этом С-пептид, не задерживаясь на колонке, выходит первым, за ним элюируются примеси, которые в стартовых условиях не сорбируются на колонке. Далее элюирует белок в режиме линейного градиента от 0 до 100%-ного буфера 50 мМ ацетат натрия рН 4,0, 5 М мочевина и 0,5 М NaCl против исходного буфера в течение 7 ч (общий объем элюента 25 л). По окончании элюции колонка уравновешивается 9 л исходного буфера для следующего хроматографического цикла. Фракции, содержащие С-пептид без примесей, собирают в объеме 2,5-12 г. Фракции, содержащие инсулин без примесей, собирают в объеме 7,5 л 14 г. Чистота получаемого таким способом С-пептида составляет 85-95% Чистота получаемого таким образом инсулина составляет 95% На сорбенте SP-Тойоперл 550 С фирмы Toson Corp, Япония, позволяющем выделять инсулин с чистотой не менее 95% белок С в чистом виде за одну хроматографическую стадию получить не удалось, т.к. вместе с белком С выходят все примеси, в результате фракции, содержащие С-белок, сильно загрязнены.

Как показали проведенные эксперименты, использование изобретения позволяет получать сорбенты, сочетающие высокие гидродинамические характеристики с более эффективными эксплуатационными характеристиками.

Формула изобретения

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТОВ, содержащих фосфогруппы, включающий обработку гидроксилсодержащих матриц фосфорилирующим агентом, отличающийся тем, что матрицы предварительно обрабатывают эпихлоргидрином в присутствии щелочи (pH > 12), а процесс фосфолирования производят при температуре не более 50^oС.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фосфорилирование проводят обработкой матрицы POCl₃.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что фосфорилирование проводят обработкой матрицы Na₂HPO₄.

РИСУНКИ

Рисунок 1