Способ определения иммуноглобулинового комплекса иммуноглобулин : биотин для иммунохимического анализа

 

Использование: медицина, иммунология, для определения иммуноглобулинового комплекса "иммуноглобулин-биотин" перед использованием его в иммунологических реакциях: твердофазном иммуноферментном анализе и методе флуоресцирующих антител. Сущность изобретения: с целью упрощения способа, осуществляют электрофоретическое разделение комплекса в геле 0,7% агарозы в течение 1 часа 15 мин при Н 1,2 в/см², затем гель высушивают и измеряют оптическую плотность комплекса в зоне опалесценции в геле агарозы на анализаторе колориметрическом иммуноферментном АКИ-ц-01 при длине волны 492 нм, отбирают комплекс с наибольшей величиной оптической плотности, что соответствует оптимальному соотношению иммуноглобулина и биотина в комплексе 1:4 - 1:8 (относительная электрофоретическая подвижность 2,3 - 2,5). Используемое соотношение приемов в способе позволяет качественно и количественно оценить соотношение иммуноглобулина и биотина в комплексе. 1 ил.

Изобретение относится к медицине, а более конкретно к иммунологии и предназначено для качественной и количественной оценки комплекса "иммуноглобулин-биотин" ("Иг-Б") при дальнейшем использовании его в иммунологических реакциях: твердофазном иммуноферментном анализе (ТИФА) и методе флуоресцирующих антител (МФА).

Известны различные способы "узнавания" анализируемого соединения: по определению биотина с помощью авидина (стрептавидина) микробиологическими методами, наблюдение комплекса под электронным микроскопом или по радиоактивности, когда используют меченый ¹⁴C авидин (Филиппов В.В. "Функции и синтез биотина в живом организме" М. Наука,1985, 215 с.).

Большинство же известных способов определения включения биотина в иммуноглобулин основаны на иммуноферментной реакции комплекса "Иг-Б" с авидином (стрептавидином), связанным с ферментом, и последующим проявлением фермента соответствующим субстратом [1] Недостатками существующих перечисленных выше методов являются их многоэтапность и дороговизна.

Целью данного изобретения является определение и количественная оценка комплекса "иммуноглобулин-биотин" до постановки ТИФА, МФА.

Поставленная цель достигается тем, что комплекс "Иг-Б" подвергают электрофоретическому разделению в агарозном геле, а конкретное выявление комплекса "Иг-Б" не требует специального окрашивания геля агарозы, так как комплекс в высушенном геле образует опалесцирующее пятно с различной относительной электрофоретической подвижностью, в зависимости от соотношения иммуноглобулина и биотина в комплексе, и его можно наблюдать визуально.

На втором этапе измеряют оптическую плотность комплекса (пятна в геле) на колориметрическом иммуноферментном анализаторе АКИ-ц-01 при длине волны 492 нм, предназначенном для учета результатов иммуноферментного анализа в планшетах.

Представленное сочетание приемов в предлагаемом способе позволяет качественно и количественно оценить соотношение иммуноглобулина и биотина в комплексе, что необходимо для последующих иммунохимических реакций.

Примеры конкретного выполнения.

На стеклянную пластинку размером 9x12 см наливают 0,7% гель агарозы, приготовленный на веронал-мединаловом буфере с лактатом кальция, 0,025 М. В центре пластинки пробивают ряд лунок диаметром 3 5 мм и вносят по 10 20 мкл исследуемого комплекса "Иг-Б". Электрофорез проводят при напряженности (Н) 1,2 в/см в течение 1 ч 15 мин. Затем гель, не окрашивая на белки, высушивают и измеряют оптическую плотность комплекса в зоне опалесценции на колориметрическом иммуноферментном анализаторе АКИ-ц-01 при длине волны 492 нм.

Пример 1. На чертеже приведена электрофореграмма комплекса "Иг-Б", где а) без окрашивания б) с окрашиванием Обозначения: 1 Контроль иммуноглобулина 2 Комплекс "Иг-Б" Пример 2. Таким образом, данный способ позволяет обнаруживать комплекс "Иг-Б", по величине оптической плотности можно выбрать оптимальное соотношение иммуноглобулина и биотина для ТИФА и МФА.

Использование предлагаемого способа по сравнению с известными имеет ряд преимуществ: 1. Способ позволяет оценить оптимальное соотношение иммуноглобулина и биотина в комплексе по величине оптической плотности его в зоне опалесценции, которую измеряют на анализаторе АКИ-ц-01, предназначенного для иммуноферментного анализа, того метода, в котором в дальнейшем используется комплекс.

2. Для оценки комплекса не требуется специального окрашивания.

3. Исключает применение канцерогенных субстратов и дорогостоящих реактивов.

Формула изобретения

Способ определения иммуноглобулинового комплекса иммуноглобулин биотин для иммунохимического анализа, включающий электрофоретическое разделение, биохимическое исследование образца с последующим спектроскопированием и расчетом, отличающийся тем, что образец наносят на 0,7%-ный агарозный гель и проводят электрофоретическое разделение в течение 1 ч 15 мин при напряженности Н 1,2 В/см, гель высушивают и измеряют оптическую плотность при длине волны 492 нм в зонах опалесценции с последующим отбором зоны комплекса с наибольшей оптической плотностью.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3