Способ получения пептидов

 

ОП ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (81) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 290776 (21)2385903/23-04 (23) Приоритет — (32) 2 7 . 01. " 6

<>668594

Союз Советскнк

Соцналнстнческнк

Республнк (Я) М. Кл.

С 07 С 103/52

A 61 К 37/02 (33) США ()1) 652945

Государственный комитет

СССР ио делам ивобретени» и открытий (®) УДК 547,964 ° ,4 ° 07(088.8) Опубликовано 150379. Бюллетень № 22

Дата опубликования описания 180379 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Эндрю Виктор Шалли (США) и Д.=фид Уовард Кой (Великобритания) (7Ц Заявители (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПЕПТИДОВ

Изобретение относится к способу получения новых пептидов, обладающих биологической активностью, которые могут найти применение в медицине для диагностики и терапии.

В пептидной химии для синтеза пеп- тидной цепи широко используют твердофазный метод (1), Для удаления боковых защитных групп и отщепления полимерной основы широко применяют фтористый водород с анизолом (2) .

Цель изобретения — синтез новых,пептидов, обладающих ценными фармако(5 логическими свойствами.

Поставленная цель достигается предлагаемым способом получения пептидов общей формулы Г

pyro Gf u-His-Trp-Х-Tyr-y-Leu-ArgPro-Z где Х вЂ” Ser;

У вЂ” D-Trp, D-Phe;

Z — GeyNH., 25 заключающимся в том, что соединение формулы и ии

R "(pyro) GRu-His (N -R ) -Trp-Х(йа )—

Tyr(R ) -У Leu Arg (N -R1)-Pro-Z

2. где значения Х и Y указаны выае;

2 где А — М-СН вЂ” ph — (полимерная асноба), 1 1

И РЬ предеуабпяющаи clou Бензгидрилтинабую слву

R1 — тозил;

R - 2-бромбензилоксикарбонилт

R — бенэил;

R4 — водород, обрабатывают реагентом, позволяющим отцепить все группы и полимерную основу.

Предпочтительным вариантом способа является использование для удаления защитных групп и полимерной основы фтористого водорода. Процесс ведут при 0-25О С в течение 30 мин.

Пример 1. Синтез L-пироглутамил-Ь-гистидил(тоэил)-L-триптофил-L-серил(бензил) -Ь-тироэил (2-бромбенэилоксикарбонил)-D-триптофчл-лейцил-L-аргинил(тоэил)-L-пропилглицнлбензгидриламиновой смолы R4- {pyro)GtuHis(N -В )-Trp-fer(R ) -Туг{В )-DTrp-Leu-Arg (Ф -R ) -Pro-Gf yA

1 . г

3 где R -Tos; R -2-Br-CSZE; R - Stf 1 °

R -Н; A — бензгидриламнновая смола

4. (нерастворимая полимерная подложка, 668594

15

После заНершения синтеза декапептидную смолу промывают метиленхлори- 55 дом (3 раза), затем. метанолом (3 раза) и сушат в вакууме до постоянного веса. В итоге получают принес, равный

98Ъ от ожидаемого теоретического привеса смолы.

60 содержащая в своем состане группировки типа бензгидриламина).

1,25 (1,0 ммоль) бензгидриламиноной смолы помещают в реакционный сосуд автоматического пептидного синтезатора фирмы Бекман (Модель 990), запрограммированного на проведение следующего цикла промывокг -) метиленхлоридом; б) ЗЗЪ-ным раствором трифторуксусной кислоты н метиленхлориде (2 раза в течение 2,5 и

25 мин); н) метиленхлоридом; г) этанолом; д) хлороформом; е) 10%-ным раствором триэтиламина в хлороформе (2 ч по 25 мин); ж) хлороформом; . з) ме иленхлоридом.

Промытую смолу перемешинают с

0,525 г (3,0 ммоль) трет-бутилоксикарбонилглицина в метиленхлориде н присутствии 3,0 ммоль дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь пере- 20 мешинают при комнатной температуре (22-25 С)2ч,после, чего аминокислотную смолу (т.е. полимерную подложку с присоедйненным к ней остатком трет-бутилоксикарбонилглицина) промывают последовательно метиленхлоридом (3 раза), этанолом (3 раза) и метиленхлоридом (3 раза) . Далее присоединенную аминокислоту деблокируют 33%-ным раствором трифторуксусной кислоты н метиленхлориде (двукратная обработка продолжительностью 2,5 и 25 мин каждый раз) и промывают в соответствии с заданной программой, т.е. осуществляют весь цикл промывки, описанный выше, от стадии н) до стадии з).

Затем н реактор вводят следующую по счету (с С-конца синтезируемого пептида) N-защищенную аминокислоту (3,0 ммоль) и всю последовательность 40 операций повторяют, как описано выше.

Осуществляют наращивание пептидной цепи следующими аминокислотами (каждую из которых нводят в реактор в количестве 3,0 ммоль), повторяя анало- 45 гичный цикл промывок и обработок:.

t-Boc-L-пролину t-Boo-L-аргинин-(Tos);

t-Boc-L-лейцин; t-Вос-D"òðèïòoôàí;

t-Boo-L-тироэин (2-бромбензилоксикарбонил); t-Boc-L-серин (ВЫ ); t-Boc-L-Tpu птофан; t-Boo-L-гистидин (To s )

L-пироглутаминовая кислота.

Бензгидриламиновая смола, использованная в этом примере, приобретена у фирьы ™ Бэхем Инкорпорейтед в Марина дель Рей, Калифорния и получена с использованием 1В сшивающего агента.

Пример 2. Синтез L-пироглутамил-L-гистидил-L-триптофил-L-серил-тирозил-D-триптофил-L-лейцил-L-аргинил-Ь-пролил-глицинамида, т,е. пептида формулы «I, где Х вЂ” Ser; Y — D-Trp;

Z — GEy-ИН, (pyro) G3u-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-LeuArg-GPyNH2 . Удаление защитных групп и отщепление синтезированного дек апептида от декапептидной смолы, описанной в примере 1, проводят путем обработки 1 r последней 24 мл жидкого фтористого водорода и 6 мп аниэола при при 0 С в течение 30 мин, Фтористый водород удаляют при пониженном давлении, а для удаления аниэола остаток промывают этилацетатом„

Сырой пептид чистят гель-фильтрацией на колонке (2,5 х 100 см) с сефадексом Г-25 (марки Файн ), представляющим собой химически модифицированный, поперечносшитый декстран, причем элюцию осуществляют 2М раствором уксусной кислоты в воде, Фракции, которые по данным УФ-спектроскопии имеют основные пики поглощения в области 280 нм, объединяют и упаринают досуха. В остатке получают вязкий маслообразный продукт, который вносят в колонку (2,5 х 100 см) с сефадексом

Г-25, гредварительно уравновешенным сначала с нижней фазой, а затем с верхн.ей фазой системы растворителей н-бутанол: уксусная кислота: вода (4,1:5). Элюция с помощью верхней фазы этой системы растворителей дает фракцию с одним оснонным пиком поглощения. Вещество, выделенное из этой фракции, подвергают элюции на колонке (1,4 х 94 см) с карбоксиметилцеллюлозой, Соответствующие фракции (10501190 мл) подвергают лиофилизации до постоянного веса и в остатке получают целевой продукт в виде белого пушистого порошка, выход 80 мг, Удельное вращение (ñ ) = "58,8 (с"-0,33;

1 н, уксусная кислота) .

По данным тонкослойиой хроматографии в четырех различных системах растворителей при нагрузке на пластинку

20-30 мкг вещества и проявлении парами йода с последующей обработкой пластинки реактивом Эрлиха (пятна наблюдали визуально), продукт показал себя однородным веществом, Ниже приводятся величины Rf полученные при хроматографии в различных системах:

1-бутанол:уксусная кислота1вода (4:1:5; верхняя фаза) И=0,25; этилацетат:пиридин:уксусная кислота: вода (5:5:1:.3) М 0,63," 2-пропанол:

:3. М уксусная кислота (2:1) Rf=0,38;

1-бутанол:уксусная кислота: вода: зтилацетат (1:1:1:1) Rf=0,51. Аминокислотный анализ продукта дал следующие результаты: Йи -1, 08; His0,95; Trp-2,00; Ser-0,94; Tyr-0,97

Leu-0 93; Arg 0,98; Pro-1,00)

Жу-1,02; NHy-1 03, 668594

Пример 3. Синтез Ь-пироглутамил- L-гистидил(тоэил)-I òðèïòoôèë-I, — ñåðèë(бензил)-L-тироэил (?-бромбенэилоксикарбонил)-D-фенилаланил-Ь-лейцил-I. — àðãèíèë(тозил)-L-пропилглицилбензгидриламиновой смолы:

R4-(pyro) Gfu-His(N -Рф ) -тг -Ser(R ) — 5 туг(R )-D.-Phe-Leu-Arg(N -R )-ProGty A, где R -Tos; R -2-BrCbz; R -Bzf; R -Н; 2 Ь 4

A — нерастворимая полимерная подложка бензгидриламинного типа, 10

1, 25 r (1, О ммоль) бенэгидриламиновой смолы помешают в реакционный сосуд Бекмановского автоматического синтезатора пептидов (модель 990), запрограммированного на проведение следую- 1 щего промывного цикла: а) метиленхлоридом; б) 33%-ным раствором трифторуксусной кислоты в метиленхлориде (2 раза в течение 2,5 и 25 мин; в) метиленхлоридом; г) зтанолом; д) хлороФормом; е) 10%-ным раствором триэтиламина в хлороформе (2 раза по 25 мин); ж) хлороформом; з) метиленхлоридом, После такой промывки смолу перемешивают с 0,525 г (3,0 ммоль) трет-бу тилоксикарбонилглицина в метилен:.лориде, куда прибавляют 3,0 ммоль дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают при комнатной температуре (22-25ОС) 2 ч, после чего полученную аминокислотную смолу про- 30 мывают последовательно метиленхлоридом (3 раза), зтанолом (3 раза) и метиленхлоридом (3 раза), Аминокислоту, присоединенную к полимерной подложке, деблокируют обработкой 33%-ным раст- 35 вором трифторуксусной кислоты в метиленхлориде (2 раза в течение 2,5 и

25 мин), после чего смолу промывают в соответствии с заданной программюй, т,е. осуществляют весь цикл промывки, 40 описанный выше, от стадии в) до з).

Далее проводят наращивание пептидной цепи ступенчатым методом — посредством последовательной конденсации следу щ 4 э щи аминокислот пов 45 торяя каждый раз весь цикл промывок и обработок: t-Boc-L-пролин) t-Boc-L-аргинин(Tos); t-Boc-L-лейцин; t-Boc-Р-фенилаланин; t-Boc-L-тирозин (2-Br-Cbz) t-Boc-L-серии(Вх().t-ВосФ Р

-Ь-триптофан; t-Boc-L-гистидин (Tos);

L-пироглутаминовая кислота. После saвершения синтеза полученную декапептидную смолу промывают метиленхлоридом (3 раза), затем метанолом (3 раза) и сушат в вакууме до постоянного веса. В итоге получают 100%-ный от теоретического привес смолы.

Бенэгидриламиновая смола,- использованная в этом примере, аналогична смоле примера 1. 60

Пример 4. Получение L-пироглутамил-L-гистидил-L-три птофил-L-серил-L-тироэил-D -фенилаланил-Ь-лейцил-Ь-аргинил-L-пропил-глицинамида, т,е, пептида формулы I, в которой Х вЂ” Ser; Y -D-РЛе; ZGFyNHzl (pyro)G3u-H Ь-Trp-Ser-Tyr-D-Phe-LeuArg-Pro-С уЫК

Удаление защитных групп и отщепление синтезированного декапептида от смолы, описанной в примерз 3, осуществляют посредстBOM обработки 1,5г материала 24 мл фтористого водорода и 6 мл анизола при ООС в течение

30 мин. Фтористый водород удаляют при пониженном давлении, а анизол — промывкой остатка этилацетатом.

Сырой пептид чистят гель-фильтрацией на колонке (2,5 х 100 см) с сефадексом Г-25, представляющим собой химически модифицированный сшитый дек стран, причем элюцию вещества осуществляют 2N водным раствором уксусной кислоты. Фракции, которые по данньм УФ-спектроскопии дают основной пик поглощения в области 280 нм, объединяют и упаривают досуха в вакууме. Полученный в результате маслообразный продукт наносят на колонку (2,5 х 100 см) с сефадексом Г-25, предварительно уравновешенным сначала с нижней фазой, а затем с верхней фазой системы растворителей н-бутанол:уксусная кислота: вода (4:1 :5).

Элюция с помощью верхней фазы этой системы растворителей дает фракции, которые выходят иэ колонки одним основным пиком (по содержанию желаемого вещества). Эти фракции объединяют и упаривают досуха при пониженном давлении. Остаток лиофилизуют из 0,2 н. уксусной кислоты, в результате чего получают целевой продукт в виде белого пушистого порошка. Выход продукта

158 мг; удельное вращение (с )2D

= -57,5 (c=0,55; 0,1 н. Уксусная кислота) .

Судя по результатам тонкослойной хроматографии в четырех различных системах растворителей (при нагрузке на пластинку 20-30 мкг вещества и проявлении пятен путем выдерживания пластинок в парах йода с последующей обработкой реактивом Эрлиха), полученный продукт представляет собой совершенно однородное вещество. Величины И, полученные при ис -.ользовании различных систем растворителей для TCX приведены ниже: 1-бутанол: уксусная кислота:вода (4:1:5, верхняя фаза) Rf=0,14; этилацетат:пиридин:уксусная кислота: вода (5:5:1:3) Rf=0,68; 2-пропанол: .1 М уксусная кислота (2:1) Rf=0,41;

1-бутанол: уксусная кислота: вода:этил- ацетат (1:1:1:1) Rf--.0,47. Аминокислотный анализ полученного продукта дал следующие результаты: GRu-1,01;

His-0,97у Trp-0,9Ор Ser-О,92уTyr-1,ООу

Phe-О,96;Leu-1,ОО; Arg-1,02; Pro-0,95

Gfy-1,O0; МН%-1,ОО.

Формула изобретения

1. Способ получения пептидов общей

)формулы

66859

pyro ОЕu-Hi.s-Trp-Х-Tyr-У-Leu-ArgPro-Z где Х - Ser;

Y - D-Trp, D-Phe; г - GtuNHq о т л и ч à ю шийся тем, что соединение формулы >I 5 и -(pyro)GEu-His (N -R )-Тгр-X(R3)Tyr(R )-у-Leu-Arg(N -R )-Р о-Zг где Х и У имеют указанные значения; г -сеу А, 10 где А- М-CH- Ph-(полимернаи осноба), I

Н Ph лредсаабляющая содой оенэгодролатноЬую смолу; . R - тозил;

Re - 2-бромбензилоксикарбонил;.

4 8

R - бензил; ъ

R — водород, обрабатывают реагентом, позволяющим отщепить все защитные группы и полимерную основу.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что отщепление защитных групп и полимерной основы осуществляют фтористым водородом при 0-25 С в течение 30 мин.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Стюарт Д. М., Дженнис Д. Твердофазный синтез. пептидов, М., Мир, 1971«

2. Vissen 5.,Ке Ьпф K.Х.Т, Studies оп poEypeptides, Ра (. Kl . Fragment сапдепъа(ion Ьу

azide coupling нчЕй a poKHrner бомпд рер— tide, %ес. Trav. Chem,,1970, 89, 880.

Составитель В. Волкова

P акто Е Хо ина Тех е И. Асталош Ко екто М. Пожо

Заказ 3331/54 Тираж 512 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035 Москва Ж-35 Ра ская наб д. 4/5

Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул, Проектная, 4