Способ получения средства, обладающего противовоспалительной активностью

 

Использование: изобретение относится к медицине и касается способа получения суммы экстрактивных веществ из травы горца птичьего. Для этого растительный материал, состоящий из травы горца птичьего, экстрагируют 35-45% этиловым спиртом в соотношении сырье-экстрагент 1/12-16/ в течение 60 мин 2 раза. Третью экстракцию проводят в течение 30 мин. Объединенные извлечения фильтруют, упаривают. Упаренное извлечение сепарируют, доупаривают, затем высушивают в вакуум-сушильном аппарате. Технический результат заключается в повышении противовоспалительной активности.12 табл.

Изобретение относится к области медицины и касается способа получения биологически активных веществ из растительного сырья.

Известен способ получения настоя горца птичьего, применяющегося в качестве противовоспалительного средства. Для приготовления настоя траву горца птичьего измельчают до частиц размером не более 5 мм. Измельченное лекарственное растительное сырье помещают в фарфоровую, эмалированную или из нержавеющей стали инфундирку, обливают водой комнатной температуры, взятой с учетом коэффициента водопоглощения, закрывают крышкой и нагревают на кипящей водяной бане при частом помешивании в течение 15 мин. Охлаждают 45 мин, процеживают (отжимая остаток растительного материала) и добавляют воду до предписанного объема вытяжки (ГФ X, ст. 349, ФС-42-2570-87; ГФ-XI, с.147-148).

Недостатком данного способа является относительно низкая противовоспалительная активность по сравнению с суммой, полученной по заявленному способу.

Целью изобретения является получение суммы экстрактивных веществ для повышения противовоспалительной активности. Для достижения поставленной цели растительный материал измельчают до частиц размером не более 7 мм, экстрагируют 35 45% этиловым спиртом в соотношении сырье экстрагент 1:(12-16) (с учетом коэффициента водопоглощения и ложного дна экстрактора) в течение 60 мин при температуре 60 ±2,5^oC и постоянным перемешивании. Процесс повторяют дважды. Аналогичным способом проводят третью экстракцию в течение 30 мин. Объединенные извлечения фильтруют через сукно, упаривают до 1/15 первоначального объема. Упаренное извлечение сепарируют, концентрируют доупаркой до 1/5 первоначального объема, затем высушивают в вакуум-сушильном аппарате и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Выход готового продукта составляет 15,6% от массы растительного материала. По мнению заявителя признаки, отличающие предложенное техническое решение от прототипа, являются существенными, поскольку при проведении патентных исследований не обнаружены.

Поиск и разработка новых эффективных лекарственных средств, предназначенных для профилактики и лечения заболеваний почек и мочевыводящих путей, обусловлены широким распространением, особой тяжестью их течения, приводящих к потере трудоспособности населения. Актуальность разработки лекарственных препаратов из растительного сырья обусловлена низкой токсичностью и многосторонним мягким воздействием широкого комплекса биологически активных веществ растений на основные факторы патогенеза. Учитывая потребности практического здравоохранения в лекарственных препаратах растительного происхождения для лечения заболеваний почек и мочевыводящих путей, разработан способ получения суммы биологически активных веществ из травы горца птичьего.

Предложенный способ позволяет получить конечный продукт, представляющий собой мелкодисперсный порошок коричневого цвета, потеря в массе при высушивании 2,3% 1. На основании качественного фитохимического анализа суммы экстрактивных веществ установлено наличие: 1) Флавоноидов: двумерной восходящей хроматографией на бумаге марки "Filtrak" FN 12 в системах растворителей: I изопропанол уксусная кислота вода (2:5:5) II H бутанол уксусная кислота вода (40:12:28).

При просматривании хроматограммы в УФ свете при λ = 365 нм до и после проявления 5% раствором алюминия хлорида обнаружены: кверцетин Rf 0,22 (I), R_f 0,73 (II); мирицетин R_f 0,60 (I), R_f 0,40 (II); гиперозид R_f 0,66 (I), R_f 0,55 (II); авикулярин R_f 0,60 (I), Rf 0,65 (II). Идентификацию проводили с аутентичными образцами.

2) кумаринов: хроматографией в тонком слое на пластинках Silufol в системе толуол - этилацетат уксусная кислота (5:4:1), опрыскивая хроматограммы 2 н спиртовым раствором едкого кали. При просматривании хроматограммы в УФ свете при λ = 365 нм обнаружены умбеллиферон (R_f= 0,60) и скополетин (R_f 0,42).

Идентификацию проводили с аутентичными образцами.

3) дубильных веществ: при добавлении по каплям 1% раствора желатина к водному извлечению образуется муть, исчезающая при избытке желатина; при добавлении к водному извлечению 2 3 капель раствора железоаммониевых квасцов, появляется черно-синее окрашивание и осадок.

4) Фенолкарбоновых кислот: одномерной восходящей хроматографией на бумаге марки FN 17 в системе растворителей: 1 н бутанол уксусная кислота вода (4:1:2); 11 15% уксусная кислота.

После обработки хроматограммы в парах аммиака и просматривании в УФ - свете идентифицированы с достоверными образцами.

Кофейная кислота R_f 0,80 (I), R_f 0,42 (II).

Хлорогеновая кислота R_f 0,67 (I), R_f 0,70 (II).

2.Количественное определение.

Сумма флавоноидов Спектрофотометрическим методом (ГФ XI изд.) найдено 4,72± 0,1527 суммы флавоноидов в пересчете на авикулярин. Предлагаемый способ получения достаточно прост, не требует сложной схемы очистки, позволяет получить продукт постоянного состава. Технология может быть внедрена на предприятиях Минмедпрома.

Нами изучены различные факторы, влияющие на процесс экстрагирования, состав и природа экстрагента, его соотношение с сырьем, степень измельчения сырья, температурный режим, время достижения равновесной концентрации в системе сырье-экстрагент. Количественная оценка велась по выходу экстрактивных веществ и содержанию в них флавоноидов.(См. табл. 1).

Подбор оптимального экстрагента является одним из основных моментов при получении извлечений. Экстрагент, действуя как активный компонент системы, влияет на скорость, полноту и качество экстракции биологически активных веществ из растительного материала.

В качестве экстрагентов были использованы горячая вода (80 90^oС) и этиловый спирт следующих концентраций: 20, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 96.

На основании экспериментальных данных установлено, что оптимальным экстрагентом является 35 45% этиловый спирт (Табл.2).

Нами проведено изучение зависимости выхода суммы экстрактивных веществ от соотношения сырье экстрагент. Результаты исследования представлены в таблице 3.

На основании полученных данных можно сделать вывод о том, что оптимальным соотношением сырья и экстрагента является 1:(12 16), дальнейшее увеличение количества растворителя нецелесообразно, так как не достигается эффективность экстрагирования.

Общеизвестно влияние степени измельченности растительного материала, которое ведет к увеличению поверхности экстрагируемого материала за счет разрыва клеток, а вследствие увеличения контакта его с растворителем, к ускорению процесса экстракции.

Для изучения влияния степени измельченности на выход суммы экстрактивных веществ сырье подвергалось измельчению до диаметра частиц 0,5; 1,0; 3,0; 5,0; 7,0; 10,0 мм. Результаты приведены в таблице 4.

Установлено, что оптимальной степенью измельчения для сырья является 7 мм.

С целью выбора оптимальной температуры экстрагирования изучен выход суммы экстрактивных веществ и суммы флавоноидов в интервале температур от 20 ^oC до 100^oC.

Результаты представлены в таблице 5.

На основании данных анализа установлена оптимальная температура экстракции +60±2,5^oC. Дальнейшее повышение температуры нецелесообразно, возможно разрушение термолабильных веществ.

Как видно из приведенных данных, оптимальное время экстрагирования 150 минут, при этом во время I контакта фаз (60 мин) экстрагируется 65 70% экстрактивных веществ и суммы флавоноидов. II контакт фаз (60 мин) обеспечивает выход 15 20% и III 5 10% т.е. для полного истощения сырья достаточно трехкратной экстракции (см. табл.6).

Для доказательства температуры сушки нами изучены способы сушки с применением вакуум-сушильного аппарата и методом распыления. Готовый продукт, отвечающий требованиям предварительной нормативно-технической документации, получен по 1 способу в вакуум сушильном аппарате. Для выяснения механизма разложения веществ в готовом продукте проводились термографические исследования (снята дериватограмма). Дериватограмма подтверждает, что разложение веществ начинается при температуре 112 122^oC, основное удаление влаги происходит при температуре 47 72^oC. В связи с этим, показатель потери в массе при высушивании определяли при температуре +80 - 85^oC.

Пример N 1. 5 кг травы горца птичьего измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 7 мм (сито N 70 ГОСТ 21 70). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 65л 35% этилового спирта (взятого в соотношении сырье экстрагент 1:12 с учетом коэффициента водопоглощения). Экстрагируют при температуре 55^oC и постоянном перемешивании в течение 60 минут. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно в сборник. Заливают 35% этиловым спиртом в количестве, равном слитому, и вновь экстрагируют 60 минут. Третью экстракцию проводят в аналогичных условиях в течение 30 минут. I слив 46 л, II слив 42 л, III слив 42 л. Объединенные извлечения упаривают до 1/15 первоначального объема. Концентрированный экстракт сепарируют, доупаривают до 1/5 первоначального объема, затем сушат в вакуумной сушилке. Получают 755 г готового продукта, что составляет 15,1% экстрактивных веществ от веса исходного сырья.

Аморфный порошок коричневого цвета, комкуется, потеря в массе при высушивании 2,1%
Противовоспалительную активность готового продукта оценивали по классическому методу Менкина (Ойвин, Шетель, 1961). Опыты проведены на белых беспородных крысах-самцах с исходной массой 160 180 г. Воспалительную реакцию воспроизводили путем подкожного введения белым крысам 9% раствора уксусной кислоты в объеме 0,5 мл в область спины с одновременным внутрибрюшинным введением раствора декстрана B дозе 300 мг/кг. Сумму экстрактивных веществ горца птичьего вводили в виде водного раствора внутрижелудочно в оптимальной условно-терапевтической дозе, составляющей 200 мг/кг (определение оптимальной условно-терапевтической дозы суммы экстрактивных веществ было проведено в предварительных экспериментах) в объеме 1 мл/100 г. Первое введение испытуемого средства осуществляли за 1 час до введения уксусной кислоты, а затем ежедневно 1 раз в сутки в течение 25 дней. Животные контрольной группы получали дистиллированную воду в объеме 1 мл/100 г по аналогичной схеме. В качестве препарата сравнения использовали настой травы горца птичьего, приготовленный по ГФ XI, который вводили по аналогичной схеме в объеме 1 мл/100 г. На 2, 7 и 25 сутки исследования оценивали площадь некротизированной ткани путем нанесения контура некроза на прозрачную пленку. Установлено, что курсовое введение суммы экстрактивных веществ в дозе 200 мг/кг оказывает противовоспалительное действие, снижая степень альтерации тканей при воздействии флогогенного агента (табл. 7). При этом активность используемого средства на 2 сутки исследования были аналогичной таковой у препарата сравнения.

Пример 2. 5 кг травы горца птичьего измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 7 мм (Cито N 70 ГОСТ 214-70).

Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 65 л 40% этилового спирта (взятого в соотношении сырье-экстрагент 1: 12 с учетом коэффициента водопоглощения). Экстрагируют при температуре +60^oC и постоянном перемешивании в течение 60 мин. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно в сборник. Заливают 40% этиловым спиртом в количестве, равном слитому, и вновь экстрагируют. Третью экстракцию проводят в аналогичных условиях в течение 30 мин. I слив 47,0 л; II слив 46,0 л; III слив 45,0 л.

Объединенные извлечения упаривают до 1/15 первоначального объема. Концентрированный экстракт сепарируют, доупаривают до 1/5 первоначального объема, затем сушат в вакуумной сушилке. Получают 780 г готового продукта, что составляет 15,6% экстрактивных веществ от веса исходного сырья.

Аморфный порошок коричневого цвета, комкуется, потеря в массе при высушивании 2,3%
Исследовали острую токсичность суммы экстрактивных веществ по общепринятому методу Кербера (Требования 1984). Опыты проведены на 36 беспородных белых крысах обоего пола с исходной массой 160 180 г. Испытуемое средство в виде водного раствора вводили внутрибрюшинно в дозах от 1000 до 2250 мг/кг. Наблюдение за животными проводили в течение 14 суток.

Проведенные исследования показали, что ЛД₅₀ суммы экстрактивных веществ при внутрибрюшинном введении белым крысам составляет 1895,8 мг/кг (1489^oC2301). Полученные результаты позволяют классифицировать испытуемое средство как малотоксичное вещество по классификации Сидорова К.К. (1973). Противовоспалительную активность суммы экстрактивных веществ оценивали с использованием модели воспаления по методу Менкина (Ойвин, Шетель, 1961) на 18 белых крысах. Описание модели и схемы эксперимента см. в предыдущем разделе. Испытуемое средство в виде водного раствора вводили в дозе 200 мг/кг.

Полученные результаты приведены в табл. 8.

Как следует из приведенной таблицы, сумма экстрактивных веществ в дозе 200 мг/кг оказывает противовоспалительное действие, о чем свидетельствует существенное уменьшение площади некротизированной ткани у крыс, получавших испытуемое вещество по сравнению с контролем. При этом противовоспалительная активность предлагаемого средства была выше, чем у настоя горца птичьего.

В следующей серии экспериментов исследовали противовоспалительную активность суммы экстрактивных веществ на модели острого перитонита (Александров и соавт. 1986). Опыты проведены на 24 белых беспородных крысах-самцах массой 180 200 г. Острый перитонит вызывали внутрибрюшинным введением 1 мл 0,2% водного раствора нитрата серебра. Сумму экстрактивных веществ в виде водного раствора вводили внутрижелудочно в дозе 200 мг/кг в объеме 1 мл/100 г за 30 мин и через 1 час после инъекции нитрата серебра. Животным контрольной группы вводили такой же объем дистиллированной воды. Крысам следующей группы вводили настой горца птичьего по 1 мл/100 г, служивший препаратом сравнения. Через 3 часа после введения нитрата серебра животных декапитировали. Брыжейку фиксировали смесью Карнуа и окрашивали 0,05% раствором толуидинового синего. С целью оценки противовоспалительной активности измеряли объем экссудата в брюшной полости животных и подсчитывали количество дегранулированных тучных клеток в брыжейке на каждые 100 клеток в поле зрения. (См. табл. 9).

Данные, представленные в таблице 9, свидетельствуют, что сумма экстрактивных веществ, вводимая на фоне острого перитонита, способствует достоверному уменьшению объема экссудата в брюшной полости, однако, на степень дегрануляции тучных клеток в брыжейке испытуемое средство существенного влияния не оказывает. При этом активность суммы экстрактивных веществ была аналогичной таковой у настоя горца птичьего.

В дополнительной серии экспериментов исследовали влияние суммы экстрактивных веществ на течение острой почечной недостаточности (ОПН), поскольку, как известно, многие заболевания почек протекают на фоне воспалительных процессов (Тареев, 1973).

Опыты проведены на 108 беспородных белых крысах-самцах массой 160 180 г. Модель ОПН воспроизводили путем внутрибрюшинного введения животным 1 мл 2% раствора сулемы (Соколова и соавт. 1975). Сумму экстрактивных веществ в виде водного раствора вводили внутрижелудочно в дозе 200 мг/кг в объеме 1 мл/100 г предварительно за 1 час до введения сулемы, а затем 1 раз в сутки на протяжении всего эксперимента. Крысы контрольной группы получали эквиобъемное количество дистиллированной воды в те же сроки. В качестве препарата сравнения использовали настой травы горца птичьего в объеме 1 мл/100 г. Фармакотерапевтическую эффективность препаратов оценивали по уровню гиперазотемии, развивающейся на фоне ОПН. Для этого, на 1, 3 и 7 сутки опыта животных забивали декапитацией и в сыворотке крови определяли содержание мочевины диацетилмонооксимным методом и креатинина методом Поппера с использованием набора реактивов "БИО ЛА Тест" (ЧССР).

Полученные результаты представлены в табл. 10.

Как следует из приведенной таблицы, превентивно-терапевтическое введение суммы экстрактивных веществ в дозе 200 мг/кг на фоне ОПН оказывает выраженное гипоазотемическое действие, способствуя существенному снижению концентрации мочевины и креатинина в сыворотке крови животных, получавших испытуемое средство во все сроки исследования. При этом, фармакотерапевтическая эффективность суммы экстрактивных веществ превосходила таковую у препарата сравнения, о чем свидетельствует более низкий уровень азотистых метаболитов в крови животных, получавших испытуемое вещество.

Пример 3. 5 кг травы горца птичьего измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 7 мм (Сито N 70 ГОСТ 214 70). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 65 л 45% этилового спирта (взятого в соотношении сырье-экстрагент 1:12 с учетом коэффициента водопоглощения). Экстрагируют при температуре 65^oC и постоянном перемешивании в течение 60 мин. Извлечения фильтруют через серошинельное сукно в сборник. Заливают 45% этиловым спиртом в количестве, равном слитому, и вновь экстрагируют в течение 60 мин. Третью экстракцию проводят в аналогичных условиях в течение 30 мин. I слив 47,5 л; II слив - 45,0 л; III слив 44,0 л.

Объединенные извлечения упаривают до 1/15 первоначального объема. Концентрированный экстракт сепарируют, доупаривают до 1/5 первоначального объема, затем сушат в вакуумной сушилке. Получают 770 г готового продукта, что составляет 15,2% экстрактивных веществ от веса исходного сырья. Аморфный порошок коричневого цвета, комкуется, потеря в массе при высушивании 2,5%
Изучали противовоспалительную активность суммы экстрактивных веществ с использованием модели воспаления по методу Менкина (Ойвин, Шетель, 1961) (описание модели и схемы опыта см. в разделе "пример 1"). Испытуемое средство в виде водного раствора вводили внутрижелудочно в дозе 200 мг/кг по вышеописанной схеме.

Установлено, что курсовое введение суммы экстрактивных веществ в указанной дозе оказывает противовоспалительное действие, снижая степень повреждения тканей при воздействии флогогенного агента. (См. табл. 11.)
Сравнительная характеристика заявляемого способа с выбранным прототипом представлена в табл. 12.

Источники информации:
1. Александров П.Н. Сперанская Т.В. Бобков Ю.Г. и соавт. Влияние рутина и эскуламина на некоторые модели асептического воспаления // Фармакол. и токсикол. 1986. N 1, с. 84-86.

2. Геращенко Г.Л. Бандюкова В.А. Самохин И.И. Противовоспалительная активность биофлавоноидов. Материалы 3-го съезда фармацевтов БССР. 1977. с. 187-188.

3. Государственная Фармакопия X издания. М. Медицина, 1968.

4. Государственная Фармакопия XI издания. М. Медицина, 1987.

5. Лекарственные препараты, разрешенные к применению в СССР. Под ред. А. А. Клюева и Э.А. Бабаяна. М. 1979.

6. Машковский М. Д. Лекарственные средства. Ч.I. М.Медицина, 1988. с. 624.

7. Ойвин И. А. Шетель С.Л. Методика изучения местных нарушений капиллярной проницаемости // Материалы по патогенезу воспаления и патологии белков крови. Душанбе. 1961. Т.49, N 5. с. 167-173.

8. Пономарев В. Д. Экстрагирование лекарственного сырья. М. Медицина, 1976. с. 202
9. Сидоров К. К. О классификации токсичности ядов при парентеральных способах введения // Токсикология новых промышленных химических веществ. М. 1973. С. 47-51.

10. Соколова В.Е. Васильченко Е.А. Любарцева Л.А. Влияние препаратов из видов леспедеци на азотистый обмен кроликов // Растит. ресурсы. 1975. Т.2, N I. с. 90-94.

11. Тареев Е.М. Острая почечная недостаточность // Сов. медицина. 1973. N 10. С. 39-46.

12. Требования к доклиническому изучению общетоксического действия новых фармакологических веществ: Временные методические рекомендации. М. 1984.

13. Хворост П. П. Комиссаренко Н.Ф. Флавоноиды Polugonum aviculare L. //Химия природн. соедин. 1980. N 6. c. 840.

14. Яковлев А. И. Чурилов Т.И. Скокова И.Г. Промахова С.С. Химическое исследование горца птичьего // Тез. докл. III Всесоюзн. съезда фармацевтов. Кишинев: Тимпул, 1980. c. 210.

15. Swiatek, Lucyan; Dombrowcz, Elzbieta. Phenolic acides in medicinal Plant drugs of Polygonum species. Farm. Pol. 1987, 43 (7-8), 420-423.

16. Schimmer, Oskar. Flavonoids. Their role as biologically active natural product. Dtsch. Apoth. Ztg. 1986. 126 (35). 1811-16.

Формула изобретения

Способ получения средства, обладающего противовоспалительной активностью, путем экстрагирования травы горца птичьего, отличающийся тем, что измененный до частиц размером не более 7 мм растительный материал экстрагируют 35-45% этиловым спиртом в соотношении сырье экстрагент 1:(12-16) 2 раза по 60 мин, третью экстракцию осуществляют в течение 30 мин, объединенные извлечения упаривают, очищают сепарированием, концентрируют доупаркой и высушивают в вакуум-сушильном аппарате.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12