Способ получения гиалуронидазы

 

Изобретение относится к производству лекарственных препаратов, применяемых в медицинской практике, и касается способа получения препаратов из животного сырья. Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта. Для достижения этой цели проводят измельчение бычьих семенников с последующей экстракцией полученного гомогената 0,1 н. раствора уксусной кислоты, экстракт отделяют от жмыха на фильтровальной ткани и концентрируют ультрафильтрацией в тангенциальном потоке на мембранах с порогом задержания 5 - 15 кД. Концентрат подвергают двухкратному замораживанию - оттаиванию с удалением осадка гемопигментов и высокомолекулярных примесей. Выход целевого продукта по сравнению с прототипом повышается в два раза, процесс технологичен и не требует громоздкого оборудования и больших площадей. 2 табл.

Изобретение относится к производству лекарственных препаратов, применяемых в медицинской практике, и касается способа получения препаратов из животного сырья.

Известные способы получения гиалуронидазных препаратов (1-5) основаны на выделении фермента из жидкого субстрата путем его денатурации с последующей ренатурацией (осаждение органическими растворителями, фракционирование сульфатом аммония, осаждение в изоэлектрической точке). Однако ферменты животного происхождения высоколабильны и изменение их агрегатного состояния приводит к частичной необратимой денатурации, что в итоге негативно влияет на выход целевого продукта и сроки хранения готового препарата.

Действующий регламент производства лидазы (1) предусматривает экстракцию гомогената бычьих семенников раствором уксусной кислоты, отделение экстракта от жмыха, выделение фермента путем осаждения 5-кратным объемом ацетона, растворение осадка и его переосаждение с последующей промывкой ацетоном, сушкой на воздухе, растворение и приготовление лекарственной формы препарата.

Указанное производство является взрывоопасным, многостадийным и нетехнологичным, требует больших объемов ацетона, громоздкого оборудования и огромных производственных площадей. Кроме того, выход целевого продукта с 1 л сырья недостаточно высок.

Цель изобретения повышение выхода целевого продукта.

Цель достигается тем, что экстракт бычьих семенников после отделения от жмыха концентрируют методом ультрафильтрации в тангенциальном потоке на мембранах с порогом задержания 5-15 кД, а затем подвергают процедуре 2-кратного замораживания-оттаивания для освобождения от гемопигмента и высокомолекулярных соединений.

Выбор мембран с указанной селективностью обусловлен молекулярной массой тестикулярной гиалуронидазы, которая, по данным различных источников, колеблется от 15 до 90 кД (1, 6). Необходимо отметить описанную в литературе способность гиалуронидазы образовывать ди- и тетрамеры, а также связываться в комплексы с альбумином и некоторыми полисахаридами (7, 8). Этими фактами можно объяснить безуспешность предпринятых нами попыток очистки нативного фермента от высокомолекулярных примесей ультрафильтрацией с порогом задержания 100 300 кД.

Сравнение предлагаемого способа с известным показывает, что общими признаками для них является получение экстракта бычьих семенников в присутствии уксусной кислоты, освобождение от жмыха, концентрирование и приготовление лекарственной формы. Однако в отличие от прототипа заявляемый способ предусматривает концентрирование экстракта более технологическим методом ультрафильтрации и очистку от гемопигмента и высокомолекулярных примесей замораживанием-оттаиванием концентрата.

Использование ультрафильтрации вместо ацетонового осаждения позволяет сконцентрировать целевой продукт более щадящим методом без изменения агрегатного состояния фермента и тем самым повысить его выход в два раза, а последующая очистка путем двухкратного замораживания-оттаивания обеспечивает удаление гемопигментов и высокомолекулярных примесей.

В литературе нет сведений об использовании ультрафильтрации и замораживания-оттаивания в производстве ферментных препаратов животного происхождения, следовательно, заявляемый способ соответствует критериям "новизна" и "изобретательский уровень".

Способ осуществляют следующим образом.

Пример 1.

75 кг замороженных бычьих семенников измельчают электромясорубкой, добавляют в фарш 100 л 0,1 н. раствора уксусной кислоты, охлажденной до температуры 6^oC, экстрагируют при периодическом перемешивании в течение 4 ч, освобождают экстракт от жмыха на фильтровальной ткани и концентрируют до объема 40 л ультрафильтрацией в тангенциальном потоке на мембранах с порогом задержания 5 кД (ВПУ-5, аппарат АР-2Н, О КБ ТБМ, г. Кириши) при рабочем давлении 0,05 0,1 МПа. Полученный концентрат разливают в полиэтиленовые бачки по 5 10 л, подвергают процедуре последовательного замораживания (при минус 10 20^oC) оттаивания (при комнатной температуре), после чего удаляют образовавшийся осадок и вновь замораживают. После повторного оттаивания и удаления осадка препарат контролируют на соответствие требованиям ФС.

Пример 2.

Выделение фермента проводят согласно примеру 1, но с использованием мембран с порогом задержания 15 кД (ВПУ-15, аппарат АР-2Н). Характеристика полученных по примерам 1, 2 препаратов приведена в табл. 1.

Сравнительная характеристика способов получения лидазы приведена в табл. 2.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет исключить из технологии производства лидазы ацетон, повысить технологичность процесса, сократить производственные площади, повысить выход целевого продукта в два раза.

Использованные источники информации 1. Технологический регламент производства лидазы. Ленинград, 1982.

2. Авторское свидетельство СССР N 302123, А 61 K 19/00, 1971.

3. Авторское свидетельство СССР N 566875, C 12 D 13/00, 1977.

4. Авторское свидетельство СССР N 827068, А 61 К 37/48, 1981.

5. Авторское свидетельство СССР N 632703, C 07 G 7/02, 1978.

6. Harrison R.A. "Biochem. J." 1988, 252 875 882.

7. Стекольников Л.И. и соавт. Сб. научн. тр. 1-го Московского медицинского института, М. 1977.

8. Максименко А.В. и соавт. "Бюлл. экспер. биол. и мед.", 1986, 11 567 569.

Формула изобретения

Способ получения гиалуронидазы, включающий измельчение семенников крупного рогатого скота, экстракцию уксусной кислотой в течение 4 ч, фильтрацию с последующей очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что фильтрат подвергают ультрафильтрации в тангенциальном потоке на мембранах с порогом задержания 5 15 кД, затем осуществляют двукратное замораживание и оттаивание, отделяют осадок и собирают надосадочную жидкость, содержащую целевой продукт.

РИСУНКИ

Рисунок 1