Способ получения цитохрома р-450

 

Использование: биотехнология и касается получения фермента цитохрома Р-450 из биомассы микроорганизмов. Сущность изобретения: способ заключается в том, что сырец фермента, полученный высаливанием сульфатом аммония в концентрации 50 - 80% от насыщения из разрушенных клеток микоплазм Acholeplasma laidlawii ИЭМ-1, последовательно очищают гельфильтрацией на сефадексе Г-75, ионообменной хроматографией на смоле ДЭАЭ-ТСК 650 С и повторной гельфильтрацией на Биогеле 150 р. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к области биотехнологии, а именно, к способам получения цитохрома Р-450 из культуры микроорганизмов.

Цитохром Р-450 относится к группе ферментов, осуществляющих окислительные процессы, и находит практическое применение в медико-биологических исследованиях.

Целью изобретения является повышение удельной активности цитохрома Р-450 из клеток микоплазм, обеспечиваемое максимальным сохранением его активности.

Указанная цель достигнута в результате того, что в качестве продуцирующей культуры использовали культуру клеток микоплазм, очистку фермента осуществляли последовательно гельфильтрацией на сефадексе G-75, ионообменной хроматографией на смоле DEAE-TSK и повторной гельфильтрацией на носителе Biogel 150P.

Сущность способа заключается в том, что 18-часовую культуру клеток Acholeplasma laidlawii, например, штамм ИЭМ-1, депонированный в лаборатории микоплазм и L-форм бактерий Института эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР, выращивают на минимальной среде желательно в присутствии толуола в концентрации 0,05 об. экстракции фермента из клеток и его последующей очистки.

Культивирование клеток можно проводить на среде, 1 л которой содержит: 10 г пептона, 1 г триптозы, 5 г хлористого натрия, 1,3 г хлористого калия, 4 г Триса, рН=8,2-8,4. Перед посевом клеток в среду добавляют сыворотку крупного рогатого скота до концентрации 6 об. 1 об. 40% раствора глюкозы, пенициллин 500 ед/мл. Культивирование клеток проводят при 37^oC примерно 18 часов. После этого в культу вносят толуол до требуемой концентрации и инкубируют 3 ч при постоянном встряхивании в колбе с притертой крышкой. Затем клетки осаждают, осадок ресуспендируют в К-фосфатном буфере (рН 7,6 со стабилизаторами), отделяют неразрушенные клетки, а затем мембраны. После удаления мембран проводят высаливание фермента сухим сульфатом аммония 50 - 80% от насыщения. Все процедуры при выделении проводят при 4^oC. Осадок, полученный при высаливании, растворяют в К-фосфатном буфере и наносят на колонку с сефадексом G-75, уравновешенную тем же буфером. Фракцию, содержащую цитохром Р-450, наносят на колонку с ДЭАЭ-ТSK и элюируют цитохром Р-450 линейным градиентом KCl. Фракции, содержащие цитохром Р-450, концентрируют и наносят на колонку с Biogel 150Р.

В результате очистки получен электрофоретически гомогенный препарат фермента с очисткой в 30 раз, выходом по активности 50 60% обладающий предельной активностью 4,7 4,9 нМ/мг белка.

В табл. 1 показана эффективность отдельных этапов предложенного способа.

Использование процедуры экстракции фермента из клеток и его последующей очистки позволяет получить конечный продукт в виде гомогенного препарата, обладающего предельной активностью в 30 раз превышающей удельную активность фермента в клетках.

Было установлено, что при использовании в качестве продуцента цитохрома Р-450 культуры А. laidlawii оказалось возможным сузить границы высаливающих концентраций сульфата аммония, так как при 40% насыщения (что используется в известном способе) высаливаются лишь балластные белки.

Конечная цель выделение биологически активного фермента из клеток микоплазм достигается лишь при условии определенной последовательности предложенных операций, что вытекает из представленных в табл. 3 данных.

Более подробно сущность предложенного способа поясняется следующим примером.

Пример. Культивирование клеток проводят на 10 л среды, 1 л которой содержит 10 г пептона, 1 г триптозы, 5 г хлористого натрия, 1,3 г хлористого калия, 4 г Триса, рН 8,2 8,4. Перед посевом клеток в среду добавляют сыворотку крупного рогатого скота до концентрации 6 об. 1 об. 40%-ного раствора глюкозы, пенициллин 500 ед/мл. Культивирование клеток проводят при 37^oC в течение 18 ч. После этого в культуру вносят толуол до концентрации 0,1 об. и инкубируют еще 3 ч при постоянном встряхивании в колбе с притертой крышкой. Затем клетки осаждают центрифугированием при 1000g в течение 15 мин. Осадок клеток суспендируют в 20 мМ К-фосфатном буфере [рН 7,6 с добавлением 0,5 мМ EDTA и 1 мМ дитиотреитола (защита цитохрома от инактивации)] и дезинтегрируют ультразвуком на 22 кГц 5 раз по 10 с с 30-секундными интервалами на льду при мощности 100 Вт. Далее осаждают неразрушенные клетки при 12000g в течение 20 мин, а полученный супернатант центрифугируют при 105000g в течение 1,5 ч для осаждения мембран.

После удаления мембран проводят высаливание сухим сульфатом аммония, медленно добавляя соль и контролируя рН раствора, равное 7,6 с помощью 10%-ного КОН. Для выделения гомопротеина используют ступенчатое высаливание: 1-я фракция содержит белки, полученные при концентрации сульфата аммония, равной 0 50% от насыщения при 4^oC 2-я 50 80% от насыщения. Все процедуры при выделении проводят при 4^oC. Осадок, полученный при высаливании 50 80% раствором сульфата аммония, содержит практически весь цитохром Р-450 и используется для дальнейшей очистки. Эту фракцию растворяют в 10 мл 50 мМ К-фосфатного буфера рН 7,6 с добавлением 0,5 мМ дитиотреитола и наносят на колонку 2,5 х 70 см с сефадексом G-75 Supergine (Pharmacia, Швеция) со скоростью 15 мл/час, уравновешенную тем же буфером.

Фракции, содержащие цитохром Р-450, наносят на колонку 2,5 х 5 см с DEAR-TSK 650S (TOUYSoda, Япония), уравновешенную тем же буфером со скоростью 100 мл/ч. После отмывки 1 объемом колонки, элюирование белков проводят линейным градиентом 0 0,4 М KCl. Фракции, содержащие цитохром Р-450, концентрируют на фильтре ХМ-100 до конечного объема 5 мл и наносят на колонку 2,5 х 70 см с Biogel 150p (BioRad, США) со скоростью 10 мл/ч.

В результате очистки получено 100 нмоль электрофоретически гомогенного препарата фермента с очисткой в 30 раз, выходом по активности 55% обладающего удельной активностью 4,9 нмоль/мг белка.

Формула изобретения

1. Способ получения цитохрома Р-450, предусматривающий выращивание продуцирующей культуры, разрушение клеток продуцента, высаливание сульфатом аммония активной фракции и ее последовательную очистку гельфильтрацией, ионообменной хроматографией и гельфильтрацией, отличающийся тем, что в качестве продуцирующей культуры используют штамм культуры клеток микоплазм Acholeplasma laid lawii ИЭМ-1, выращенный в присутствии 0,05 0,01 об. толуола, гельфильтрацию осуществляют на сефадексе G-75, ионообменную хроматографию выполняют на смоле DEAE TSK65OS, а повторную гельфильтрацию проводят на Biogel 150 Р.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что концентрацию сульфата аммония устанавливают равной 50 80% от насыщения.

РИСУНКИ

Рисунок 1