Способ получения ликопина

 

Использование: в пищевой промышленности, в частности в области биотехнологии, для получения ценного пищевого красителя и антиоксиданта - ликопина. Сущность изобретения: выращивают мицелиальный гриб Blakeslia trispora в присутствии соединений класса аминометилпиридинов или природного стимулятора ликопинообразования табачной крошки. Ликопинсодержащую биомассу отделяют от культуральной жидкости, ликопин экстрагируют подсолнечным маслом, ведут перекристаллизацию органическими растворителями и далее используют колоночную хроматографию по окиси алюминия.

Изобретение относится к области биотехнологии, в частности к способу получения ликопина.

Ликопин является природным соединением (каротиноидом) и синтезируется растениями, водорослями и грибами. Ликопин имеет густую розовую окраску, переходящую в фиолетовый оттенок, что представляет большой интерес для пищевой промышленности, которая остро нуждается в природных безвредных красителях такого оттенка.

Использование ликопина для придания розового цвета пищевым изделиям обеспечивает им улучшенный товарный вид и позволяет одновременно обогатить продукты ценными биологическими свойствами, способствующими сохранению здоровья. Дело в том, что в последние годы показано, что ликопин присутствует в тканях человеческого организма, в частности в плазме, в количествах, больших, чем другие каротиноиды [1] Кроме того, установлено, что способность тушить синглетный кислород у ликопина выше не только по сравнению с другими каротиноидами, но и с такими известными антиоксидантами, как, например, α-токоферол [2] Эти данные заставили с новых позиций подойти к использованию ликопина не только как дефицитного красителя, но и мощного антиоксиданта. Известно, что соединения, способные ингибировать в организме процессы свободнорадикального окисления, влияют на иммунный статус организма, улучшая протекание ряда важнейших биологических процессов, в частности липидный метаболизм, пролиферацию, зрение и др.

Химический синтез ликопина в отличие от b-каротина представляется пока экономически невыгодным и достаточно сложным. Ликопин получают из растительного сырья, в частности из томатов Lycopersicon sp. [3] Однако этот метод обладает рядом недостатков: связан с сезонностью, зависит от климатических колебаний, грибной инфекции, в частности урожай томатов может быть полностью уничтожен грибом Phythophtora sp. Кроме того, выход ликопина не превышает 0,3-0,4 мг на г плодового тела, причем кроме основной all-trans-формы ликопина присутствует также неоликопин A и проликопин, что значительно затрудняет очистку целевого продукта [3] Указанных недостатков может быть лишен микробиологический способ получения ликопина. Однако у бактерий, например, Streptomyces chresomyceticus var. rubescens процесс получения ликопина занимает около 8 суток [4] что приводит к удорожанию конечного продукта. Больше ликопина способны синтезировать грибы, и особенно мицелиальные, среди которых активным синтетиком ликопина является гриб Blakeslea trispora [5] Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту является способ получения ликопина [6] согласно которому продуцентом является микроскопический гриб Blakeslea trispora (+) 701 и (-) 4 штаммы. Выращивание проводят на среде, содержащей глюкозу, аспарагин или бактопептон, дрожжевой и (или) картофельный экстракты, растительное масло 1-3% твин 20 или твин 21 и гетероциклические стимуляторы синтеза ликопина соединения класса аминопиридинов и никотин, при температуре 26-30^oC в течение 48 час, далее добавляют гетероциклические стимуляторы ликопинообразования и твины. Ферментацию продолжают еще 24 час, при этом общее время процесса без учета выращивания посевного материала составляет 72 час. Далее биомассу отделяют от среды, промывают водой, растирают кварцевым песком под слоем ацетона, гомогенезируют, аликвотную часть, содержащую ликопин, отделяют на стеклянном фильтре N 1, к этому ацетоновому фильтрату добавляют гексан и воду, получают гексановый экстракт, концентрируют его на роторном испарителе. Выход ликопина 200-300 мг на 1 л среды. Чистота ликопина приблизительно 90% около 10% составляет b-каротин. Далее проводят хроматографирование в тонком слое окиси алюминия с использованием системы растворителей: н-гексан-ацетон (175:5).

Недостатками данного способа являются недостаточно высокий выход ликопина, наличие в среде выращивания компонентов (аспарагин, твины, глюкоза), являющихся в настоящее время либо дефицитными, или дорогостоящими, использование штаммов, не прошедших специальную селекционную обработку и не способных поэтому к дальнейшему увеличению пигментной активности. Кроме того, в качестве стимуляторов ликопинообразования вносят гетероциклические соединения в количестве до 0,4% что может привести к обогащению целевого продукта производными пиридина, а также используют такое дефицитное и дорогостоящее соединение, как никотин. Не указано также соотношение (+) и (-) спор в посевном материале. Этот факт и то, что засев ферментационной среды ведется споровым материалом, получение которого не описано, может привести к невоспроизводимости результатов и снижению выходов целевого продукта.

Целью данного изобретения является разработка более эффективного способа получения ликопина из мицелия грибов, удешевление процесса и расширение числа продуцентов.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что мицелиальные грибы, относящиеся к порядку Phycomycetes, семейству Choanephoraceae - Blakeslea trispora A-732-3(+) и A-732-2(-) [7] (+)8 и (-)8A [8] выращивают раздельно в течение 48 час и в соотношении 1:9 соответственно, далее вносят в ферментационную среду и культивирование (+) и (-) штаммов продолжают в течение 3 сут при температуре 27-28^oC. Используют мучную среду, содержащую кукурузной муки 17,3 г на 1 л среды, соевой муки 40 г на 1 л среды, KH₂PO₄ 0,5 г на л среды и 4% подсолнечного масла и стимулятор ликопиноообразования не используемое ранее производное пиридина или природный производственный отход табачную крошку. Выход ликопина составляет по данным спектрофотометрического метода 0,4-0,7 г на 1 л среды. Далее ликопинсодержащую биомассу, отделенную от культуральной жидкости, подвергают экстракции по принципу противотока подсолнечным маслом при соотношении биомасса: масло (1:1) при 85^oC в течение 30 мин. Для кристаллизации ликопина насыщенный экстракт выдерживают при 12-15^oC в течение 3 сут. Кристаллы отделяют отстаиванием и получают 0,8%-ную суспензию кристаллического ликопина в масле. Далее препарат дважды промывают этанолом в соотношение 1: 5 при 50^o и получают кристаллы, содержащие 47% ликопина. Дальнейшая очистка производится перекристаллизацией из толуола кипящим абсолютным этанолом. В результате получают кристаллический 97% ликопин.

При необходимости для получения более очищенного ликопина используют для отделения оставшихся примесей каротиноидов колоночную хроматографию на окиси алюминия 3-4 степени по Брокману в системе растворителей н-гексан-ацетон (50:1). После элюции растворителем (10%-й этанол в н-гексане) ликопина с сорбента получают препарат ликопина, практически не содержащий примеси каротиноидов.

Пример 1. Готовят споровый посевной материал, используя для этих целей картофельно-морковную среду, которую засевают A-732-3(+) и A-732-3(-) штаммами Blakeslea trispora. Выращивание спорового материала ведут на косячках в стеклянных пробирках (L 20 см, d 2 см) в течение 6-7 сут при температуре 28-29^oC. Полученными спорангиоспорами (+) и (-) штаммов раздельно засевают ферментационные колбы, содержащие гидролизную среду указанного ниже состава. Ферментацию ведут в течение 48 час на качалках, работающих со скоростью 200 оборотов в минуту.

Состав гидролизной среды: 47 г соевой муки, 23 г кукурузной муки, добавленные в колбу, содержащую 1 л воды, далее вносят 2,8 мл концентрированной серной кислоты и стерилизуют при 1 атм 1,5 час. После стерилизации устанавливают pH 6,7-6,8 и добавляют 0,5 г KH₂PO₄.

Раздельно выращенные на гидролизной среде (+) и (-) штаммы гриба подвергают в стерильных условиях обработке в специальных колбах с отбойниками (встряхивают на качалке в течение 1 час). Далее разбитый на отдельные фрагменты мицелий (+) и (-) штаммов используют для засева в соотношении 1:9 соответственно. Ферментацию ведут на мучной среде указанного выше состава в течение 72 час на качалках при температуре 27-28^oC. Стимулятором ликопинообразования является ранее не используемое соединение - 2-амино-6-метилпиридин, которое в концентрации 0,005% вносят в ферментационную среду при 0 час ферментации, т.е. вместе с посевным материалом (48-часовыми мицелиями).

Выход ликопина составляет 0,7 г на 1 л среды, при этом соотношение ликопина к одновременно образовавшемуся b-каротину составляет 11:1.

Пример 2. То же, что в примере 1, но 2-амино-6-метилпиридин вносят в концентрации 0,01% Выход ликопина составляет 0,63 г на 1 л среды.

Пример 3. То же, что в примере 1, но 2-амино-6-метилпиридин вносят в количестве 0,002% Выход ликопина составляет 0,60 г на 1 л среды.

Пример 4. То же, что в примере 1, но в качестве продуцентов используют штаммы (+) 8A и (-) 8A Blakeslea trispora. Выход ликопина составляет 0,64 г на 1 л среды.

Пример 5. То же, что в примере 1, но в качестве стимулятора ликопинообразования вносят ранее не использованное соединение 2-амино-5-метилпиридин в концентрации 0,01% т.е. 0,1 г на 1 л среды. Выход ликопина составляет 0,61 г на 1 л среды.

Пример 6. То же, что в примере 5, но стимулятор ликопинообразования вносят в концентрации 0,005% т.е. 0,05 г на 1 л среды. Выход ликопина составляет 0,49 г на 1 л среды.

Пример 7. То же, что в примере 5, но стимулятор ликопинообразования вносят в концентрации 0,025% т.е. 0,25 г на 1 л среды. Выход ликопина составляет 0,57 г на 1 л среды.

Пример 8. То же, что в примере 1, но в качестве стимулятора ликопинообразования используют природный отход от производства табака - табачную крошку, которую в количестве 1% т.е. 10 г на 1 л среды вносят в ферментационную мучную среду. Выход ликопина составляет 0,4 г на 1 л среды.

Пример 9. То же, что в примере 1, но соотношение (+) и (-) мицелиев в посевном материале составляет 1:4 соответственно. Выход ликопина составляет 0,63 г на 1 л среды.

Пример 10. То же, что и в примере 8, но соотношение посевных (+) и (-) мицелиев составляет 1:4 соответственно. Выход ликопина составляет 3,9 г на 1 л среды.

Пример 11. То же, что в примере 1, но в качестве штаммов-продуцентов используют (-) 4 и (+) 701 штаммы Blakeslea trispora. Выход ликопина составляет 0,38 г на 1 л среды.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет значительно повысить выход целевого продукта за счет использования новых стимуляторов ликопинообразования, относящихся к аминометилпроизводным пиридина, и одновременно снизить их концентрацию в среде выращивания; за счет установления оптимальных соотношений (+) и (-) мицелиев в посевном материале; расширить число применяемых штаммов-продуцентов, используя при этом более продуктивные штаммы грибов, а также удешевить стоимость конечного продукта, особенно, учитывая тот факт, что в качестве стимулятора ликопина предлагается вводить отход от производства табака табачную крошку. Необходимо отметить, что по технологии выращивания и схеме выделения конечного продукта предлагаемый способ более соответствует заводским условиям, чем прототип.

Источники информации 1. Goodruch J. Barker C. Phelps R. J. Chem. Educ. 1993, v. 70, N 6, P. A158.

2. Mascio P.Di. Kaiser S. Sies H. Arch. Biochem. Biophys. 1989, v. 264, N 2, P. 532.

3. Porter J.W. Zscheile F.P. Arch. Biochem. 1946, v. 10, N 1, P. 537.

4. Patent USA N 3467579, 1969.

5. Patent France N 1403839, 1965 6. АС 1080479, 1983 (прототип).

7. Феофилова Е.П. Михайлова М.В. Садовова Н.В. Микробиология, 1993, Т. 62, В. 4, С. 625-632.

8. АС N 851968, 1981.

Формула изобретения

Способ получения ликопина, включающий выращивание мицелиального гриба - продуцента Blakeslea trispora на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, растительное масло, воду, гетероциклические соединения - стимуляторы ликопинообразования и получение целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют штаммы Blakeslea trispora А-732-3(+) и А-732-3(-), 8А(+) и 8А(-), выращивание (+) и (-) штаммов осуществляют раздельно в течение 48 ч, полученный посевной материал используют в соотношении 1 9 для последующей ферментации, при этом в состав питательной среды дополнительно вводят источник фосфора-KH₂PO₄ в количестве 0,05% в качестве источника углерода и азота использует 4% соевой муки и 1,75% кукурузной муки, из растительного масла используют подсолнечное масло в количестве 4% а количество воды составляет 90,5% стимуляторы ликопинообразования соединения класса аминометилпиридинов вносят при 0 ч ферментации в количестве 0,01 0,005% а стимулятора ликопинообразования - табачную крошку в количестве 1% причем получение целевого продукта осуществляет экстракцией подсолнечным маслом, кристаллизацией с использованием этанола и толуола и последующей колоночной хроматографией в системе: н-гексан-ацетон 50 1.