Способы измерения электрохемилюминесцентных явлений и определения анализируемого вещества и реактив

 

Изобретение может быть использовано при анализе состава вещества. Сущность изобретения заключается в том, что измерение электролюминесценитных явлений позволяет проводить анализ специфического вещества, обнаруживаемое излучение представляет собой критерий для присутствия анализируемого вещества. 2 с. и 7 з.п. ф-лы, 6 табл.

Изобретение относится к способам для измерения электрохемилюминесцентных явлений, способам определения анализируемого вещества посредством таких способов, реактивы в виде растворов, которые могут быть использованы в этих способах, и аппарат, особенно пригодный для осуществления такого способа.

Способы измерения электрохемилюминесцентных явлений известны в течение нескольких лет. В таких способах используется способность специальных комплексов металлов попадать в результате окисления в такое состояние, из которого они при выделении электромагнитного излучения снова впадают в нормальное (основное) состояние. Такие способы и пригодные для этого комплексы металлов известны (WO 86/02734).

Такая технология постоянно усовершенствовалась. В публикации WO 90/05296 к составу пробы добавляют амин, предпочтительно трипропиламин, который в окисленной форме представляет собой сильный восстановитель. Электрохимическая реакция происходит в электролите, в котором остаток электрохемилюминесценции (ECL), т. е. комплекс металлов, способный к электромагнитному излучению, и амин могут окисляться. Как соответствующий электролит в водном растворе описывается фосфатный буфер при pH 6-9, преимущественно 7 - 7,5.

В известном способе к этому составу пробы для повышения электромагнитного излучения добавляют моющее средство (детергент) тритон X-100 или тритон N-401. В WO 90/05411 описано усовершенствование аппарата для измерения электрохемилюминесценции.

Далее удалось использовать технологию определения (обнаружения) анализируемого вещества в результате того, что маркировки электрохемилюминесценции на анализируемых веществах, аналогах анализируемых веществ или на веществах, специфических для анализа, были соединены. Электрохемилюминесценцию применяли для определения количества присутствующего испытываемого вещества. В частности, были описаны такие иммуно-анализы, в которых обычные маркировки заменены на электрохемилюминесцентные маркировки.

Дальнейшие усовершенствования и случаи применения этой технологии описаны в публикациях WO 87/06706, WO 89/04392, WO 89/10552, WO 89/10551, WO 90/05301 и WO 90/11511.

Задача изобретения заключалась в том, чтобы усовершенствовать предварительно известные способы, особенно относительно чувствительности определений анализируемых веществ, которые возможны с помощью технологии электрохемилюминесценции.

Предметом изобретения является способ измерения электрохимических явлений в растворе или на твердой фазе, граничащей с раствором. При этом такой раствор содержит моющее средство (детергент), выбранное из группы этоксилатов спирта жирного ряда, "плантарена" и октилглюкозида или смеси из этих веществ.

Далее предмет изобретения - это способ определения анализируемого вещества с помощью этих способов, а также соответствующие реактивы для осуществления названного способа.

В предмете изобретения речь идет о техническом решении, созданном на вышеназванном уровне техники. Общие основы электрохимических люминесцентных способов подробно описаны в этом уровне техники. Приборы для осуществления измерений электрохемилюминесценции содержат измерительный узел с емкостью для раствора реактивов, по меньшей мере два электрода (один рабочий и один противоположный электрод), которые во время измерения находятся в контакте с раствором реактивов, и один детектор для измерения производимого посредством электрохемилюминесценции света. В общем, в этих способах сначала к раствору подается выходное напряжение (преполяризация / подготовительная поляризация). После этого это напряжение повышается через окислительно-восстановительный потенциал содержащегося в растворе вещества, например амина. Посредством окисляемого в результате этого вещества материал, способный к хемилюминесценции, например определенные рутениевые комплексы, возбуждается для излучения света. Свет, улавливаемый детектором в течение определенного времени, - это и есть мера (критерий) для присутствия определенного количества электрохемилюминесцентного материала. Поскольку при наличии электрохемилюминесцентного материала речь идет о маркировке для анализируемого вещества, аналога анализируемого вещества или специфического для анализа вещества, например в иммуно-анализе, то принимаемый свет - это критерий для присутствия анализируемого вещества.

Оказалось, что известное и обычно добавляемое до настоящего времени моющее средство - тритон X-100, которое на практике в большинстве случаев использовалось в сочетании с моющим средством "твин" (Tween)-20, не является оптимальным. С одной стороны, тритон X-100 плохо расщепляется и, следовательно, неблагоприятно переносится окружающей средой. С другой стороны, неожиданным образом выяснилось, что совершенно определенные другие моющие средства (детергенты) по сравнению с тритон X-100 способствуют усовершенствованию электрохемилюминесцентного способа. С помощью этих специальных моющих средств обеспечивается повышенный выход сигналов, лучшее соотношение сигнал/шум и, таким образом, повышенная чувствительность способа определения и понижение нижнего предела обнаружения, а также лучшая точность.

Для указанной задачи пригодными оказались моющие средства, выбранные из группы этоксилатов спирта жирного ряда, среди которых, например, следует понимать полидоканол (додецилполи-(этиленгликольэфир)_n), C14 E09 (поли(этиленгликоль-эфир)_n), генапол (изотридецил -поли(этиленгликольэфир)_n), C8-E09 (октанол-поли(этиленгликольэфир)_n), плантарен® (алкилполиглюкозид) и октилглюкозид (октил-бета-D-глюкопиранозид) или их смесь. Моющие средства используются в концентрациях 0,001 - 1,0 %. Наиболее пригодная концентрация может быть легко определена для каждого моющего средства. Концентрации 0,1 - 0,5% оказались наиболее пригодными.

Для консервации до сих пор к составу пробы добавляли азид натрия, обычно в концентрации 5 - 10 mM. Оказалось, что этот вредный для окружающей среды реагент можно заменить биобаном или оксабаном, которые в значительной мере благоприятнее для окружающей среды, чем азид.

Неожиданным образом обнаружилось, что эти консерванты оказывают дальнейший положительный эффект на электрохемилюминесцентный способ. По сравнению с азидом наблюдается повышение измерительного сигнала. Оксабан и биобан используются при этом в концентрации 0,01 - 1%, предпочтительно 0,1 - 0,5 %.

Предложенный способ измерения электрохимических явлений в растворе или на граничащей с раствором твердой фазе может быть осуществлен при температурах, находящихся выше точки замерзания раствора, но ниже 40^oC.

Дальнейшее улучшение чувствительности может быть достигнуто в ходе того, что на измерительный узел подается напряжение, прохождение которого по времени - прямоугольно. Это означает, что, исходя из напряжения на выходе осуществляется непосредственный подъем напряжения (в течение максимально 0,4 с) до напряжения на конце. Для времени возбуждения это напряжение поддерживается, в основном, постоянным. Спустя это время, напряжение снова возвращается непосредственно до напряжения ниже окислительно-восстановительного потенциала системы. В результате этих мер получается, кроме того, расширение динамического диапазона измерения, то есть того диапазона, в пределах которого могут быть измерены концентрации анализируемого вещества определенной иммуно-пробы. На случай низких температур предпочтительна солевая добавка.

Оказалось, что предпочтительно концевое напряжение прямоугольной формы (по сравнению с Ag (AgCl)), подаваемое на рабочий электрод, ограничить до максимальной величины между окислительно-восстановительным потенциалом окисляемого вещества и 2,2 В. Особенно предпочтительным является напряжение в пределах между 1,2-2,2 В, особенно предпочтительно 1,4 В. Эти величины действительны для применения платиновой или золотой пары электродов.

В случае, если подается обычное до сих пор линейное пилообразное напряжение, например напряжение треугольной формы, то конечное напряжение (по сравнению с Ag/AgCl) ограничивают до максимальной величины 3,0 В.

Неожиданным образом можно было достичь также повышения сигнала в ходе того, что напряжение на выходе перед возбуждением электрохемилюминесценции составляло на рабочем электроде между +400 и -400/mV/мВ no сравнению с Ag/AgCl-электродом. Особенно предпочтительной является величина в пределах между +0 и +200 мВ. Также и здесь действительны величины для применения пары платиновых или золотых электродов. Потенциалы для других материалов электродов могут быть легко рассчитаны.

Точно также и повышение сигнала можно рассчитать в результате регулирования pH 6,5-9,0, предпочтительно 6,5-7,5, особенно предпочтительно 6,8. Это происходит надлежащим образом благодаря применению pH-буфера, пригодного для этого диапазона. Дополнительно может содержаться еще один или несколько щелочных или щелочноземельных галогенидов концентрацией 0,05 - 0,5 моль/л в растворе. Предпочтительно используется хлорид натрия.

Вышеназванные меры сами по себе приводят уже к значительным усовершенствованиям известного способа. Помимо этого, однако, в особенно значительной степени может быть повышена чувствительность и/или динамический диапазон измерения определения анализируемого вещества а результате комбинации этих мер.

Повышение чувствительности определения анализируемых веществ, например, в иммуно-пробах, как по сэндвичевому или по конкурентному способу, позволяет дальнейшие упрощения способа или применяемых аппаратов. Например, теперь возможно как детектор применять фотодиод, упрощать калибрацию системы, из-за незначительного времени измерения при повышенном сигнале увеличивать число проведенных тестов за единицу времени или уменьшать объемы проб.

Точно также предметом изобретения является раствор реактивов для измерения электрохимических явлений, в частности для определения анализируемого вещества, содержащего окисляемый электрохимическим способом амин, который в окисленном состоянии представляет собой сильный восстановитель, который содержит моющее средство, выбранное из группы этоксилатов спирта жирного ряда, "плантарена®" и октилглюкозида или смесь из них. Дополнительно может содержаться еще щелочной хлорид концентрацией 0,1 - 0,5 моль/л и/или pH может быть равным 6,8 - 8,0. Далее могут содержаться еще обычные добавки, например буферные вещества, стабилизаторы и консерванты.

Раствор реактивов подлежит консервации посредством биобана или оксабана.

Аппарат для осуществления определения посредством электрохемилюминесценции известен.

Аппарат, помимо этого, может содержать средство для охлаждения измерительного узла и/или емкости для жидкости до температуры 0 - 25^oC, если способ должен быть осуществлен при этих низких температурах. Под измерительным узлом здесь следует понимать ячейку, в которой осуществляется измерение электролюминесценции. Под емкостью для жидкости можно понимать сборник или, однако, ввод, например шланг, для раствора реактивов, имеющегося во время измерения в измерительном узле.

Также предметом изобретения является способ определения анализируемого вещества посредством электрохемилюминесцентной маркировки. При этом применяется один из вышеназванных способов измерения электрохемилюминесцентных явлений.

Пример 1. В (одной) серии опытов был установлен эффект используемых согласно изобретению моющих средств (детергентов). Для того, чтобы можно было определить влияние моющих средств на образование сигналов по возможности независимо от отдельных параметров теста, т.е. к определенным анализируемым веществам, использовались покрытые стрептавидиновой оболочкой магнитные частицы, на которых было соединено биотинилированное и одновременно рутенилированное антитело (HSAP: "hot-Streptavidin - Partikel" горячие частицы стрептавидина).

Для измерения использовали известный аппарат, который далее в измерительной ячейке содержал постоянный магнит (Origen 1,0 от IJEN, Rockville, USA или Magnalyber) (магнитный анализатор). Этот инструмент содержит также фoтoэлeктpoнный умножитель, стабилизатор напряжения, электрохимическую расходную ячейку, средство для передачи жидкости и пробный (испытательный) ротор для 50 туб.

Для определения соединяли в одной тубе: HSAP(лиофилизированные HSAP растворяли в трис/полидоканол-буфере (10 mM; 0,1%) pH 9,0 так, что получался рабочий раствор в количестве 600 rg/мл 50 rl; RBS-буфер (50 mM KH₂PO₄; 100 mM NaCl; 0,1% RSA, pH 7,0) 200 rl.

Раствор реактивов (200 mM KH₂PO₄-буфер, 100 mM ТРА; pH 7,5, соответственно испытанный реактив).

Эту смесь добавляли пипеткой в измерительную тубу, а затем переводили в измерительную ячейку. HSAP промывали буфером (АВ) и в этом буфере измеряли выход сигналов.

Применяемое антитело биотинилировали посредством биотин-DDS (биотинил-амино-3,6-диоксаоктаноил- аминокарбонилгептановая кислота- N-оксисукцинимид-эфира). (Трис) (2', 2'-бипиридил) рутенийхлоридгексагидрат связывали с помощью DSS (дисукцинилсуберат) с антителом.

Магнитные частицы, покрытые стрептавидиновой оболочкой, были получены от фирмы "Deutsche Dynal GMBH" ("Дойче Динал ГмбХ"), Германия (Dynabeads М-280 Streptavidin).

Буфер (АВ), который применяли при измерении, имел следующий состав: KH₂PO₄·2H₂O - 0,2 M KOH - 0,076 M NaCl - 0,05 mM TPA (трипропиламин) - 0,1 М Моющее средство - В концентрациях, указанных в табл. 1 Оксабан/биобан - 0,1 /0,3% pH - 7,5
Как контроль, использовали обычные до сих пор моющие средства Tween 20 (твин 20) и тритон Х-100, соответственно, в концентрации 0,05 %. Для сравнения в табл. 1 выход сигнала, полученный посредством этого моющего средства, рассматривали, как 100 %. Как следующую величину измерения, определяли неспецифический выход сигнала в буфере (АВ) и таким образом устанавливали отношение выхода сигнала HSAB/AB. Это отношение между выходом сигнала с HSAP и без HSAP представляет собой хороший признак для чувствительности теста. Из результатов табл. 1 ясно можно увидеть, что предложенные моющие средства (детергенты) являются наиболее подходящими.

Полидоканол и С8-Е09 показывают наилучшее влияние на отношение HSAP/АВ. Другие моющие средства по сравнению с твин/тритон Х-100 вызывают ухудшение выхода сигнала.

В табл. 1 имеются следующие обозначения использованных детергентов:
C8-E09: октанолполи(этиленгликолевый эфир)_n;
C14-E09: поли(этиленгликолевый эфир)_n;
C16-E09: цетилполи(этиленгликолевый эфир)_n;
Додецилмальтозид: додецил-β-D-глюкопиранозил(1->4)-α-D-глюкопиранозид;
Генапол: изотридецилполи(этиленгликолевый эфир)_n;
Октилглюкозид: октил- β-D-глюкопиранозид;
Плантарен: алкилполиглюкозиды (C14-C16);
Ралуфон 3-14: n-тетрадецил-n,n-диметил-3-амино-1-пропансульфонат;
SDS: содийлаурилсульфат;
Полидоканол: додецилполи(этиленгликолевый эфир)_n;
Тритон Х-100: октилфенолполи(этиленгликолевый эфир)_n;
Твин (Tween): поли(оксиэтилен)_n-сорбитан-монолаурат.

Пример 2. На примере не зависимого от параметров теста (HSAP) воспроизводится действие температуры ячейки на нахождение сигнала и динамику на случай напряжения рампы при 28 - 35^oC в измерительной ячейке в зависимости от NaCl.

Этот тест был осуществлен, как показано в примере 1. Вместо буфера (AB) применяли буфер BMG2 со следующим составом:
H₃PO₄ - 0,2 M
Полидоканол - 0,1 %
Оксабан - 0,1 %
Трипропиламин - 0,16 М
KOH - 0,12 М
pH - 6,8
NaCl - Концентрация, указанная в табл. 2.

Результаты представлены в табл. 2. В результате повышения температуры и концентрации соли увеличиваются электрохемилюминесцентные (ECL) сигналы, которые были получены с помощью буфера (BMG2) только лишь и с помощью HSAP.

Отношения HSAP/AB, HSAP/FC и FC/AB почти не зависимы от температуры, но зависимы от концентрации соли.

Понижение температуры ниже 20^oC требует добавки щелочного хлорида и pH предпочтительно 7,25 - 7,75.

Пример 3. Определение T₃.

На примере иммуно-анализа для определения трийодтиронина (T₃) предложенный состав теста BMG1 сравнивается с составом теста уровня техники (BMG0):
Растворы реактивной имеют состав, приведенный в табл. 3.

Следующие другие реагенты использовались:
HERES-буфер 7,0:
HERES-Na pH 7,0, 0,1 М
0,06% ANS
0,1% IgG - крупного рогатого скота
0,5% Byco (бико)
50 mM NaCl
PAK-RU (рутенилированное поликлонарное антитело)
(Трис) (2,2'-бипиридил) рутенийхлоридгексагидрат, связанный посредством DDS с PAK против T₃ в HERES-буфере 7,0 - 100 нг/мл
HP-BI (T₃-полигаптен биотинилированный)
PH PAK <-> K-IgG (DE)BOC-T₃-IBi в HERES-буфере 7,0 - 600 нг/мл
Пробы: стандарт a-e
концентрация T₃:
a) 0,24 нг/мл
b) 0,88 нг/мл
c) 1,90 нг/мл
d) 3,05 нг/мл
e) 6,65 нг/мл
3 сыворотка человека
2 сыворотка человека без (с 500 мг/дц) гемоглобина (Hb)
Магнитные частицы, покрытые оболочкой из стрептавидина:
Dynabeads М-280 Streptavidin (Динабеадс М-280 Стрептавидин ("Deutsche Dynal GMBH", Германия) "Дойче Динал ГмбХ" в HERES-буфере 7,0 - 600 мкг/мл.

Для (проведения) определения были соединены:
PAK-RU - 50 мкл (rl)
Dynabeads М-280 - 50 мкл
Проба - 30 мкл
PH-Bi - 50 мкл
BMG 0 или 1 - 500 мкл
Эту смесь инкубировали в течение 16 мин при температуре 28^oC, после этого переводили в измерительную ячейку с поддерживаемой равномерной температурой до 28^oC, а частицы промывали с помощью BMG 0 или 1 в зависимости от композиции теста и осуществляли в ней измерение. Было подано напряжение рампы между фазами. Напряжение измерения составляло 0,565 В, а PMT 720 мВ.

Результаты представлены в табл. 4. Оказалось, что нарушение гемоглобина, которое можно наблюдать в BMG 0, предотвращается в BMG 1. Нижний предел обнаружения не испытывает никакого влияния.

Пример 4. Определение HBs Ag.

Предложенный состав теста MBG 1 испытывали по сравнению с BMG 0 на примере сэндвичевого иммуно-анализа для обнаружения HBS Ag. BMG 0 и 1 имели составы, указанные в примере 3.

Следующие реактивы использовались:
HERES-буфер pH 7,5:
HERES - Na - 0,05 М
Сывороточный альбумин крупного рогатого скота - 1%
Генапол X 080 - 0,1%
IgG - крупного рогатого скота (R) - 0,1%
IgM - мыши - 10 мкг/мл
CAM - (хлорацетамид) - 0,1%
MIT (метилизотиазолон) - 0,01%
AK-Bi (антитело, биотинилированное посредством биотин-DDS)
MAK <HBs> M5A10-IgG-Bi (DDS) 1 : 7,5 в HERES-буфере pH 7,5 - 300 нг/мл
TAG (рутенилированное антитело)
MAK <HBS> M5A10 - F(ab')2-BPRU
(Трис) (2,2'-бипиридил)рутенийхлоридгексагидрат, связанный посредством DDS с моноклональным антителом против HBsAG(F(ab')-фрагмент) в HERES-буфере pH 7,5 - 500 нг/мл
Пробы: стандарт a - h
концентрация HBs Ag:
a) 0 Е/мл
b) 0,22 Е/мл
c) 0,52 Е/мл
d) 1,08 Е/мл
e) 2,30 Е/мл
f) 4,50 Е/мл
g) 10,30 Е/мл
h) 22,20 Е/мл
Магнитные частицы, покрытые оболочкой из стрептавидина:
(Динабедеадс) Dynabeads М-280 стрептавидин в HERES-буфере pH 7,5 - 600 мкг/мл
Для определения были соединены, мкл:
Dynabeads M-280 - 50 (rl)
AK-Bi - 50
TAG - 40
Проба - 50
HERES-буфер pH 7,5 - 20
BMG 0 или 1 - 150
Эту смесь инкубировали в течение 16 мин при температуре 28^oC, после этого переводили в измерительную ячейку с установившимся температурным режимом до 28^oC, а частицы промывали с помощью BMG 0 или 1 и осуществляли в ней измерение.

Результаты представлены в табл. 5. В результате применения BMG 1 можно было заметно улучшить нижний предел обнаружения. Также по сравнению с BMG 0 был понижен VK (коэффициент вариации). Отношение величин стандартных проб "h" и "a" калибровочной кривой повышено при BMG 1, в результате чего достигается лучшее дифференцирование калибровочной кривой.

Пример 5. Определение TSH.

На примере (сэндвичевого) многослойного иммуно-анализа для определения TSH (тироид-стимулируемый гормон) предложенные составы BMG 1 и BMG 1 без оксабана сравнивались по отношению к составу теста согласно уровню техники BMG 0. BMG 0 или 1 имели состав, описанный в примере 3.

Стимулируемый тироидом гормон (TSH) определяли посредством сэндвичевого иммуно-анализа. Для осуществления (определения) использовали при этом аппарат, описанный в примере 1.

Для определения были соединены:
Инкубационный буфер (содержащий 6,06 г/л (Трис) Tris·HCl 1 г/л хлорацетамида, 0,1 г/л метилизотиазолон, pH 8,0, 50 г/л сывороточный альбумин, 10 г/л R - IgG) - 50 мкл
Магнитные частицы, покрытые стрептавидиновой оболочкой (динал, 2,8 мкм) в инкубационном буфере - 600 мкг/мл (40 rl)
Биотинилированное посредством DSS (дисукцинидил суберат) моноклональное антитело (MAK) против TSH в инкубационном буфере - 3,0 мкг/мл (40 rl)
TAG:
(Трис) (2,2'-бипиридил) рутенийхлоридгексагидрат, связанный посредством DSS с MAK против TSH в инкубационном буфере - 1,2 мкг/мл (40 rl)
Жидкость для проб и/или стандарт - 50 мкл
Повторная суспензия / добавка состава реактивов (BMG 1) - 100 мкл
Эту смесь инкубировали в течение 16 мин при комнатной температуре (21^oC), а после этого переводили в измерительную ячейку до желаемой температуры измерения иммобилизующие частицы промывали раствором реактивов BMG 1 и измеряли в BMG 1.

Как пробу применяли стандарты a - e с TSH - концентрациями:
a) 0 rU/ml
b) 0,39 rU/ml
c) 3,54 rU/ml
d) 12,4 rU/ml
e) 44,3 rU/ml
Результаты отражены в табл. 6. Благодаря использованию BMG 1 по сравнению с BMG 0 достигается лучший предел обнаружения. В результате применения консерванта оксабана нижний предел обнаружения снижается еще. Однозначно в обоих примерах (BMG 1 +/- оксабан) также улучшается вариационный компонент.

Формула изобретения

1. Способ определения анализируемого вещества путем измерения электрохемилюминесцентных явлений в растворе или твердой фазе, граничащей с раствором в результате приведения в контакт способного к электрохемилюминесценции компонента с окисляемым амином, и подачи электрического напряжения для индукции электрохемилюминесценции и обнаружения электромагнитного излучения, отличающийся тем, что раствор содержит моющее вещество, выбранное из группы этоксилатов спирта жирного ряда, плантарена и октилглюкозида или их смеси, а способный к электрохемилюминесценции компонент - это маркировка анализируемого вещества, аналога анализируемого вещества или специфического для анализа вещества, причем обнаруживаемое излучение представляет собой критерий для присутствия анализируемого вещества.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве этоксилата спирта жирного ряда применяется полидоканол, С14-Е09, генапол или С8-Е09.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что раствор содержит один или несколько щелочных или щелочноземельных галогенидов.

4. Способ по пп.1 - 3, отличающийся тем, что величина pH раствора находится между 6,5 и 9,0.

5. Способ по пп.1 - 4, отличающийся тем, что электрохемилюминесценция возбуждается в результате подачи напряжения прямоугольной формы максимально 2,2 В или линейного пилообразного напряжения 3 В.

6. Реактив, представляющий собой раствор для измерения электрохимических явлений, содержащий окисляемый электрохимическим способом амин, который в окисленном состоянии представляет собой сильный восстановитель, отличающийся тем, что в нем содержится моющее вещество, выбранное из группы этоксилата спирта жирного ряда, плантарена и октилглюкозида или их смеси.

7. Реактив по п.6, отличающийся тем, что моющее средство содержится в концентрации 0,001 - 1,0%.

8. Реактив по п.6 или 7, отличающийся тем, что дополнительно содержится щелочной хлорид в концентрации 0,05 ммоль/л - 0,5 моль/л.

9. Реактив по пп.6 - 8, отличающийся тем, что он имеет pH 6,5 - 9,0.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3