Способ определения функциональной активности компонента c4 комплемента человека (варианты)

 

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах. Способ позволяет определить функциональную активность компонента С4 системы комплемента человека на основе иммуноферментного метода. Проводят сорбцию в лунках микропанели иммуноглобулинов классов G или М. Затем сорбируют раствор, содержащий определяемый С4, в присутствии комплемента морской свинки. Количество сорбированного компонента С4 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью специфических антител против С4 человека, ковалентно связанных с ферментом. При этом в качестве сыворотки морской свинки используют сыворотку, не содержащую активный компонент С4, или цельную сыворотку морской свинки. Способ прост, надежен. 1 з.п.ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к медицинской иммунологии, а именно к способам определения функциональной активности компонентов комплемента в сыворотке крови человека при диагностике ряда заболеваний и в биологических препаратах.

Наиболее перспективным из современных методов определения белков сыворотки крови является метод иммуноферментного анализа благодаря своей чувствительности, избирательности и возможности автоматизации аналитического процесса. Однако имеющиеся на сегодня методы иммуноферментного анализа белков комплемента позволяют определять лишь их содержание как антигена. Тем не менее наиболее информативным является оценка функциональной активности этих белков, которая и характеризует развитие патологического процесса. Что касается определения функциональной активности компонентов комплемента, то практически единственным является гемолитический метод [1], не отличающийся высокой степенью воспроизводимости и неохотно используемый клиницистами из-за трудностей, связанных с приготовлением гемолитической системы на основе эритроцитов барана.

Нами разработан способ, позволяющий определять функциональную активность компонента C4 системы комплемента человека на основе иммуноферментного метода.

Способ осуществляется следующим образом: проводят последовательную сорбцию в лунках микропанели сначала иммуноглобулинов классов G или M, нативных или агрегированных предварительным нагреванием, затем определяемого C4 из растворов, его содержащих, в присутствии сыворотки морской свинки, дефицитной по C4 или цельной. Количество ковалентно связавшегося в результате активации компонента C4 определяют по продукту ферментативной реакции с помощью антител к C4 - фракции иммуноглобулинов G, ковалентно связанных с ферментом. Способ основан на способности функционального активного компонента C4 ковалентно связываться с агрегированными иммуноглобулинами классов G и M сыворотки крови человека или животных в результате каскада реакций активации компонентов комплемента - C1 из сыворотки морской свинки на агрегированных IgG или IgM, связанных на подложке и C4 с помощью активированного C1, связанного с агрегированными иммуноглобулинами.

Пример 1. Определение функциональной активности препарата C4. Растворяют иммунохимически чистый IgG или IgM в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, pH 9,5, в концентрациях белка 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4^oC. Два раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Ca²⁺ и 0,5 мМ Mg²⁺ (VBS⁺⁺), по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета ряда вносят по 100 мкл раствора, содержащего C4 в растворе VBS⁺⁺, в виде прогрессивных двукратных разведений. Во все лунки планшета вносят по 10 мкл сыворотки морской свинки, не содержащей активного компонента C4. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oC, двукратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента C4 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oC и двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг ортофенилендиамина в 25 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Функциональную активность препарата C4 рассчитывают по стандартной кривой.

Этим методом проведено определение активности C4 в 6 образцах сыворотки крови человека и стандартным гемолитическим методом [1]. Получены результаты (в величинах эффективных молекул в 1 мл на 10¹²), приведенные в таблице.

Пример 2. Определение функциональной активности препарата C4. Растворяют агрегаты IgG или IgM, полученные предварительным нагреванием при 63^oC, в 0,05 М натрий-карбонатном буфере, pH 9,5, в концентрациях белка 10-100 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора в каждую лунку плоскодонного полистиролового 96-луночного планшета. Закрывают крышкой и оставляют на ночь при 4^oC. Два раза отмывают планшет вероналовым буферным раствором, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl, 0,15 мМ Ca²⁺ и 0,5 мМ Mg²⁺ (VBS⁺⁺), по 150 мкл в каждую лунку, затем планшет осушают путем вытряхивания остатка жидкости. В лунки планшета ряда вносят по 100 мкл раствора, содержащего C4 в растворе VBS⁺⁺, в виде прогрессивных двукратных разведений. Во все лунки планшета вносят по 10 мкл цельной сыворотки морской свинки. После инкубации в термостате в течение 30 мин при 37^oC, двукратной отмывки фосфатным буфером, pH 7,4, содержащим 0,15 М NaCl и 0,05% твин-20, и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл конъюгата пероксидазы с антителами против компонента C4 человека в том же буфере в подобранном разведении. После инкубации в термостате в течение 1 ч при 37^oC и двукратной отмывки с детергентом и осушения планшета в каждую лунку вносят по 100 мкл субстратного буфера (10 мг ортофенилендиамина в 25 мл цитратно-фосфатного буфера, pH 5,0, и 50 мкл 3% перекиси водорода). После 30 мин инкубации в темноте реакцию останавливают внесением в каждую лунку 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывают с помощью спектрофотометра с вертикальным лучом измерением светопоглощения при 492 нм. Функциональную активность препарата C4 рассчитывают по стандартной кривой.

Литература 1. Козлов Л.В., Крылова Ю.И., Чих В.П., Молчанова Н.Н. Модифицированные методы определения функциональной активности факторов комплемента C2, C3, C4 и C5. Биоорганическая химия. 1982. Т. 8. N 5. С. 652-659.

Формула изобретения

1. Способ определения функциональной активности компонента С4 комплемента человека, отличающийся тем, что сорбируют в лунках микропанели неспецифические иммуноглобулины G или М человека или животных, в лунки микропанелей вносят раствор, содержащий компонент С4, и сыворотку морской свинки, не содержащую активного компонента С4, проводят инкубацию, а затем вносят конъюгат фермента с антителами против компонента С4 человека и субстрат этого фермента, после чего проводят определение активности С4 по продукту ферментативной реакции.

2. Способ определения функциональной активности компонента С4 комплемента человека, отличающийся тем, что сорбируют в лунках микропанели неспецифические иммуноглобулины G или М человека или животных, в лунки микропанелей вносят раствор, содержащий компонент С4, и цельную сыворотку морской свинки, проводят инкубацию, а затем вносят конъюгат фермента с антителами против компонента С4 человека и субстрат этого фермента, после чего проводят определение активности С4 по продукту ферментативной реакции.

РИСУНКИ

Рисунок 1