Способ прогнозирования течения посттравматического периода политравмы опорно-двигательного аппарата

 

Изобретение относится к медицине, в частности травматологии. Способ основан на определении в сыворотке крови большого уровня антител к тропомиозину и актину с помощью иммуноферментного анализа. В качестве антигена в лунки полистиролового планшета сорбируют тропомиозин и актин, растворенные в 0,05 М карбонатно-бикарбонатном буфере при рН 9,6. При этом используют тропомиозин в концентрации 30 мкг/мл, а актин - 20 мкг/мл. В качестве используемой сыворотки крови используют сыворотку, разведенную 1-2% раствором бычьего сывороточного альбумина в соотношении 1:100 соответственно. При одновременном возрастании уровней антител к указанным мышечным белкам в течение первых двух недель после тяжелой травмы конечностей, выраженном в увеличении коэффициента экстинкции от 0,1 до 0,6, а затем синхронном снижении указанных показателей к 20-25 дню до показателей доноров прогнозируют благоприятное течение посттравматического периода. Способ информативен и достоверен.

Изобретение относится к области медицины, а именно к иммунодиагностике, и может быть применено к травматологии. Существующие клинические методы обследования больных с тяжелыми повреждениями опорно-двигательного аппарата не позволяют прогнозировать и, в результате, осуществлять оптимальный выбор тактики лечения в процессе травматической болезни. В результате воздействия травмы организм реагирует изменениями клеточного и гуморального иммунитета, зависящими от индивидуальных особенностей иммунологической толерантности человека.

В травматологии известны способы диагностики и прогнозирования течения множественных и сочетанных травм на основе динамики параметров клеточного иммунитета: реакций T-, B-, O-лимфоцитов; изменения активности T-супрессоров и T-хелперов, естественных киллеров (A E K), макрофагов и т.п. [4,5]; а также факторов гуморального иммунитета - изменение уровней иммуноглобулинов A, M, G; комплемента, пропердина, в-лизинов и др. [4,9]. Указанные параметры клеточного и гуморального иммунитета входят в характеристику общего иммунного статуса организма и подвержены изменениям не только при механических повреждениях, но и при различных заболеваниях и поэтому не могут использоваться в качестве достоверного критерия прогнозирования течения тяжелых травм опорно-двигательного аппарата [3].

Наиболее близким к предложенному по принципу использования параметров клеточного иммунитета в качестве прогностического теста является способ определения динамики активности T-клеток в культуре крови пациентов с множественными и сочетанными переломами костей путем выявления спонтанной пролиферативной активности лимфоцитов, пролиферативного ответа лимфоцитов на оптимальную концентрацию конканавалина-А (КОН-А), пролиферативного ответа лимфоцитов на оптимальную концентрацию фитогеммаглютинина (ФГА), активности короткоживущих Т-лимфоцитов супрессоров (АКС), активности естественных киллеров (АЕК).

Активность лимфоцитов исследовалась с помощью реакций бласттрансформаций (РБТ КОН-А, РБТ ФГА) [5].

Недостатком указанного способа является использование в качестве прогностического критерия показателей клеточного иммунитета, которые не являются специфическими для травматических повреждений и изменяются также при различных соматических заболеваниях [2, 3]. Кроме того, в аналоге исследуется кровь пациента, которая непосредственно не подвергается воздействию травматического агента (в отличие от мышц, костей и т.п.).

Способов, в которых используются показатели специфического гуморального иммунитета для диагностики и прогнозирования течения тяжелых травм опорно-двигательного аппарата в доступной литературе, мы не встретили.

При тяжелых механических травмах опорно-двигательного аппарата в различной степени повреждается скелетная мускулатура, что приводит к выходу некоторых компонентов миофибрилл в кроветворное русло с последующей сенсибилизацией организма, что, в частности, проявляется в выработке антител к антигенам - мышечным белкам [1].

Цель изобретения - улучшение качества прогнозирования течения посттравматического периода при политравме опорно-двигательного аппарата на основе выявленной закономерности в динамике специфического гуморального иммунитета.

Поставленная цель достигается тем, что одновременно в динамике определяется уровень антител к мышечным белкам - тропомиозину и актину, в сыворотке крови больных с политравмами опорно-двигательного аппарата методом иммуноферментного анализа.

Одновременное увеличение количества антител к тропомиозину и актину от 0,1 до 0,6 в течение 10-15 дней после тяжелой (поли) травмы конечностей, а затем последующее снижение уровня антител к указанным мышечным белкам 20-25 дню указывает на благоприятное течение посттравматического периода политравмы опорно-двигательного аппарата.

При осложненном течении посттравматического периода тяжелой травмы конечностей повышения уровня антител к тропомиозину и актину не наблюдается.

Предложенный способ реализуется следующим образом.

1. Диагноз политравмы опорно-двигательного аппарата (множественные открытые и закрытые переломы костей скелета с тяжелыми повреждениями мягких тканей) ставится на основании клинико-инструментального и рентгеновского обследования.

2. Получение сыворотки.

У больного из кубитальной вены забирали 10,0 мл крови, помещали в центрифужную пробирку, оставляли на 30 мин при комнатной температуре. Затем стеклянной палочкой отводили сгусток (для более полной ретракции) и помещали в термостат при температуре -37^oC на 1,5 ч. Кровь центрифугировали при 3000 оборотов в 1 мин в течение 15 мин, сыворотку отсасывали автопипеткой. Полученную сыворотку хранили при температуре -30^oC.

3.Подготовка антигенов.

Антигены (мышечные белки - тропомиозин и актин) выделяли из скелетной мышцы (бедренной мышцы) трупов, практически здоровых людей, погибших от несчастного случая, не позднее 6-8 ч после смерти в возрасте 20-40 лет. Актин выделяли по методу Штрауб, описанному в кандидатской диссертации Сычевой Г. Ф. (1987 г.). Полученные препараты очищали высасыванием сульфатом аммония до 20% насыщения [8].

Тропомиозин получали по методу Бейли, описанному в той же работе (Сычева Г. Ф., 1987 г.). Полученные препараты очищали высасыванием сульфатом аммония и изоэлектрическим осаждением при pH 4,5. Контроль чистоты антигенов производили по методу Weber и Osborn (1969 г.), концентрацию белка в пробах определяли спектрофотометрически при длине волны, равной 280 нм [8].

4. Постановка иммуноферментного метода определения специфических антител к мышечным белкам - тропомиозину и актину [2].

Для проведения иммуноферментного метода концентрация актина составляла 20 мкг/мл, тропомиозина - 30 мкг/мл.

Иммуноферментный анализ /ИФА/ (Elisa - тест) ставили в полистероловых планшетах объемом лунки 0,1 мл. Все ингредиенты реакции вносили в этом объеме.

4.1 Сорбция антигена.

Во все лунки вносили антигены /тропомиозин и актин/, растворенные в 0,05 м карбонатно-бикарбонатном буфере pH 9,6 в указанных выше концентрациях. Инкубация при температуре +4^oC в течение 18 ч.

4.2 Раствор антигена удаляли из всех лунок. Для блокирования свободных мест связывания во все лунки вносили 1%-ный раствор бычьего сывороточного альбумина на вышеуказанном буфере. Производили инкубацию при температуре +37^oC в течение 37 мин.

4.3 Раствор бычьего сывороточного альбумина удаляли. Все лунки планшета промывали 2 раза по 3 мин забуферным физиологическим раствором с 0,05% ТВИН-20 /ЭФР/. Исследуемую сыворотку разводили 1 - 2%-ным раствором бычьего сывороточного альбумина в концентрации 1 : 100 и вносили в каждую лунку планшета в объеме 0,1 мл, затем смесь инкубировали при температуре +37^oC в течение 1 ч.

4.4 Сыворотку удаляли, планшет промывали 4 раза по 3 мин. Инкубировали при температуре +37^oC в течение 1 ч. Затем раствор конъюгата удаляли, планшет промывали 5 раз по 3 мин промывным раствором. В лунки вносили раствор субстрата /перекись водорода с оротофенилендиамином в качестве индикатора в цитратном буфере pH-4,9. В момент появления окраски реакцию тормозили однонормальной серной кислотой. Учет результатов проводили на приборе "Миниридор" фирмы "Дайнатек" /ФРГ/. За норму принимали экстинцию менее 0,1.

Пример 1 (см. таблицу).

Клинический пример 2.

Больная К., 42 года, поступила в травматологическое отделение ГКБСМП г. Волгограда в экстренном порядке с диагнозом: Политравма. Закрытый перелом левого бедра, левой голени, шейки правого плеча со смещением отломков. Ушиб головного мозга легкой степени. Ушибленная рана лба, ушибы мягких тканей лица и конечностей. Травматический шок 2 степени.

В течение 8 дней с момента поступления проводилась противошоковая терапия; репозиция и фиксация правого плеча лонгетой; скелетное вытяжение левого бедра и голени; первичная хирургическая обработка раны головы; терапия ушиба головного мозга. На 9-й день после травмы произведены операции: внутрикостный остеосинтез левого бедра металлическим штифтом и чрезкостный остеосинтез левой голени аппаратом Илизарова. Послеоперационный период протекал гладко, раны зажили без осложнений. Через 5 недель после травмы консолидировался перелом шейки плеча, через 3,5 месяца - перелом левого бедра, через 4,5 месяца наступило сращение левой голени. Через 5 месяцев после травмы больная выздоровела. В течение всего периода лечения у больной в динамике /трижды/ определялся уровень антител к миофибриллярным белкам - тропомиозину и актину. В первые сутки после травмы количество антител к тропомиозину и актину увеличилось до 0,15 и 0,12 соответственно /норма - 0,1/. Через 10 дней после травмы уровень антител к тропомиозину и актину вырос до 0,43 и 0,57 соответственно. Через 25 дней после травмы количество антител к тропомиозину и актину снизилось до 0,2 и 0,25 соответственно. В дальнейшем уровень антител к тропомиозину и актину нормализовался, при этом течение посттравматического периода было благоприятным.

Клинический пример 3.

Больной Ч. , 23 года, поступил в травматологическое отделение ГКБСМП г. Волгограда после автодорожной аварии с диагнозом: Политравма. Открытый многоосколочный перелом костей правой голени с повреждением передней большеберцовой артерии и размозжением мягких тканей. Закрытый оскольчатый перелом костей левой голени. Сотрясение головного мозга, травматический шок 2 степени.

Через 2 ч после поступления на фоне противошоковой терапии, после стабилизации гемодинамики произведена операция: первичная хирургическая обработка раны правой голени, чрезкостный остеосинтез костей обеих голеней аппаратом Илизарова. Послеоперационный период осложнился тромбозом задней большеберцовой артерии правой голени, который купирован консервативной терапией, и развитием посттравматического остеомиелита. После неоднократных секвестриекратомий явления остеомиелита правой голени частично купированы, но сращения костей не наступило - псевдоартроз. От предложенного оперативного лечения ложного сустава правой голени больной отказался. В процессе лечения у больного четырехкратно в динамике проводились иммунологические исследования.

В первые сутки после травмы уровень антител к тропомиозину понизился до 0,08 /норма - 0,1/, к актину не изменился. К 10 дню после травмы /после купирования сосудистых и воспалительных осложнений/ количество антител к тропомиозину незначительно выросло - 0,19, а к актину осталось близким к норме. К 20 дню после травмы /развились явления остеомиелита/ уровень антител к тропомиозину снизился до нормы и сохранялся в течение всего периода лечения. При осложненном течении политравмы конечностей уровень антител к тропомиозину и актину незначительно снижается и затем нормализуется и сохраняется до конца лечения.

Таким образом, на основании динамического изменения уровня антител к мышечным белкам - тропомиозину и актину, можно прогнозировать течение посттравматического периода политравмы опорно-двигательного аппарата.

Предложенный способ прогнозирования течения политравмы опорно-двигательного аппарата прошел апробацию в травматологическом отделении ГКБСМП г. Волгограда с 11.03.92 года по 30.04.93 года. Было обследовано 53 пациента с множественными и сочетанными повреждениями: 18 человек - с множественными повреждениями конечностей; 12 человек - с сочетанными травмами внутренних органов, черепа и опорно-двигательного аппарата; 23 человека - с монотравмой конечностей и комбинированными повреждениями. Закономерность в динамике специфического гуморального иммунитета была выявлена в группе с политравмой конечностей /18 человек/ и достоверно соответствовала прогнозу на благоприятный исход в 17 случаях.

Таким образом, достоверность предлагаемого способа прогнозирования течения травм конечностей достигает 94,4%.

Рассмотренный способ прогнозирования может быть рекомендован в клиническую практику.

Формула изобретения

Способ прогнозирования течения посттравматического периода при политравме опорно-двигательного аппарата, отличающийся тем, что в сыворотке крови больного определяют уровень антител к тропомиозину и актину методом иммуноферментного анализа, при котором в качестве антигенов в лунки полистиролового планшета сорбируют указанные мышечные белки, растворенные в 0,05М карбонатно-бикарбонатном буфере (КББ) при pH 9,6, при этом тропомиозин используют в концентрации 30 мкг/мл, а актин - 20 мкг/мл, а в качестве используемой сыворотки крови сорбируют сыворотку крови больного, 1 - 2% раствором бычьего сывороточного альбумина при соотношении 1 : 100 соответственно, и при одновременном возрастании уровней антител к тропомиозину и актину в течение первых двух недель после тяжелой травмы конечностей, выраженному в возрастании величины коэффициента экстинкции от 0,1 до 0,6, а затем при синхронном снижении указанных показателей к 20 - 25 дню до показателей доноров, прогнозируют благоприятное течение посттравматического периода.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2