Субстанция липовитам е, обладающая антиоксидантной активностью, и витаминный комплекс

 

Изобретение относится к медицине, а именно к химико-фармацевтической промышленности, к созданию субстанции "Липовитам Е", витаминного комплекса. Изобретение заключается в том, что предложенная субстанция содержит альфа-токоферол ацетат и фосфолипиды или фосфатиды. Также предложен в таблетированной форме витаминный комплекс, включающий субстанцию "Липовитам Е" и дополнительно магний карбонат основной, микрокристаллическую целлюлозу, крахмал картофельный, кальций стеариновокислый. Изобретение обеспечивает повышение антиоксидантной активности и может использоваться в профилактике оксидантных повреждений клеток и тканей, вызванных различными экзогенными факторами. 2 с. и 3 з.п. ф-лы, 1 ил.

Изобретение относится к области химико-фармацевтической промышленности, а именно созданию витаминного комплекса.

Известен альфа-токоферол ацетат, который используется в медицинской практике в виде раствора и в капсулах /М.Д.Машковский "Лекарственные средства", Изд. Медицина М., 1985 г., т. 2, с. 37-38/.

Технической задачей настоящего изобретения является расширение ассортимента отечественных витаминных препаратов, необходимых для профилактики авитаминозов.

Для решения поставленной задачи предлагается группа изобретений, объединенных общим изобретательским уровнем.

Субстанция, названная "Липовитам E", содержит альфа-токоферол ацетат, фосфолипиды или фосфатиды при следующем соотношении ингредиентов в мг/г: Альфа-токоферол ацетат - 10-90 Фосфолипиды или фосфатиды - 20-180 Кроме того, предложен витаминный комплекс, включающий субстанцию, содержащую альфа-токоферол ацетат, фосфолипиды или фосфатиды. Витаминный комплекс представляет собой таблетированную форму и дополнительно содержит магний карбонат основной, крахмал картофельный, кальций стеариновокислый и микрокристаллическую целлюлозу при следующем соотношении компонентов в г на 1 таблетку массой 0,3-0,5: Альфа-токоферол ацетат - 0,0017-0,015 Фосфолипиды или фосфатиды - 0,003-0,030 Магний карбонат основной - 0,04-0,10 Микрокристаллическая целлюлоза - 0,02-0,10 Крахмал картофельный - 0,004-0,05 Кальций стеариновокислый - 0,002-0,01
Витаминный комплекс при необходимости дополнительно содержит бутилоксианизол в количестве 0,00003.

Витаминный комплекс содержит фосфатиды семян подсолнечника или фосфолипиды соевые или подсолнечника, а в качестве сорбента сорбит и/или сахарную пудру, и/или соль поваренную, и/или ксилит пищевой, и/или маннит, и/или лактозу.

Способ получения субстанции.

В качестве сорбента используют сорбит или сахарную пудру, соль поваренную, ксилит пищевой, маннит, сахар молочный (лактоза), смесь вышеуказанных сорбентов.

Расчетное количество сорбента распределяют слоем 0,2-0,3 см на металлическом подносе и высушивают при температуре 50-20^oC в течение 5 часов. Остаточная влажность сухого сорбента не должна превышать 4-6%.

Сухой сорбент измельчают до получения частиц размерами 5-20 мкм. Далее расчетные количества фосфолипидов, токоферола ацетата, хлороформа и при необходимости бутилоксианизола перемешивают в течение 30 минут. В полученный грубодисперсный порошок препарата "Липовитам E" добавляют сорбент и перемешивают при давлении до 0,1 атмосферы и температуре 40-50^oC. Процесс перемешивания продолжают в течение 5 часов. Затем порошок сушат в течение 5 часов.

Полученную субстанцию "Липовитам E" таблетируют. При этом магний карбонат основной и крахмал просеивают через сито с диаметром отверстий 0,5 мм. Кальций стеариновокислый просеивают через сито с диаметром отверстий 0,3 мм. Просеянный крахмал картофельный раскладывают тонким слоем на эмалированном поддоне и сушат в вакуум-сушильном шкафу при температуре 60^oC и остаточном давлении 1 атм. В течение 5-6 часов.

Субстанцию "Липовитам E" смешивают с магнием карбонатом основным, высушенным крахмалом и микрокристаллической целлюлозой. Полученную смесь пропускают через сито с диаметром отверстий 0,75 мм. Массу тщательно перемешивают и опудривают кальцием стеариновокислым.

Ядра таблеток "Липовитам E" прессуют на таблеточном прессе с двояковогнутыми пуансонами диаметром 9,0 или 10,0 мм. Средняя масса ядра (0,28 ± 0,03) г.

Проведено исследование биологической активности "Липовитама E". Исследование биологического эффекта "Липовитама E" включало:
а) выявление антиоксидантной активности препарата в опытах in vitro на культуре альвеолярных макрофагов крысы;
б) сравнение биологической активности "Липовитама E" (в дозе 0,5 мг/кг и 0,01 мг/кг по содержанию витамина E) и масляного раствора витамина E (в дозе 0,5 мг/кг) при введении препаратов per os ежедневно в течение 14 дней;
в) выяснение механизмов антиоксидантного эффекта "Липовитама E" путем изучения внутриклеточной кальциевой сигнальной системы.

А) Антиоксидантная активность "Липовитама E".

"Липовитам E" вносили в пробирку с культурой альвеолярных макрофагов непосредственно после стимуляции клеток пептидным препаратом FMLP. Известно, что реакция макрофагов на этот пептид сопровождается выбросом в экстраклеточное пространство свободных радикалов, в частности супероксидного аниона и гидроксильного радикала. Суммарную свободнорадикальную продукцию оценивали методом люминолзависимой хемолюминесценции, учитывая пик (максимум свечения, мВ) и время достижения пика (мин).

В контрольных опытах (без добавления в среду инкубации "Липовитама E") стимуляция макрофагов с помощью FMLP приводила (уже на первой минуте наблюдения) к возрастанию продукции свободных радикалов в 2-2,5 раза. Повышенная хемолюминесценция (как следствие продолжающейся продукции свободных радикалов) сохранялась в течение всех 10 мин наблюдения.

После введения в среду инкубации альвеолярных макрофагов "Липовитама E" (1,0 мг) происходило снижение продукции радикалов на 42% (по пику хемолюминесценценции), но через 3 мин вновь наблюдалось увеличение хемолюминесценции до уровня контроля (без "Липовитама E"). Внесение в инкубационную среду 2 мг "Липовитама E" увеличивало латентный период (до начала роста продукции радикалов) до 6 мин. И, наконец, добавлением 4 мг "Липовитама E" удавалось полностью погасить оксидантную активность макрофагов в ответ на экзогенный стимул (FMLP), более того, наблюдалось даже подавление спонтанной свободнорадикальной продукции. Реакция сохранялась и в том варианте опыта, когда 4 мг "Липовитама E" вносили в среду инкубации до стимуляции макрофагов FMLP.

Б) Биологический эффект длительного введения "Липовитама E" и масляного раствора альфа-токоферола per os здоровым животным.

При ежедневном продолжительном (в течение двух недель) пероральном применении "Липовитама E" в дозах 0,01 и 0,5 мг/кг (что соответствует приему 1 и 6 капсул препарата взрослым человеком массой тела 60 кг) не выявлено каких-либо токсических проявлений воздействия препарата. У животных сохранялись хороший аппетит, нормальные функции желудочно-кишечного тракта и диурез. При визуальном анализе при вскрытии не отмечено никаких макроскопических изменений в легких, сердце, печени, почках, надпочечниках и других органах. Параметры биометрии (легочный коэффициент, сердечный и надпочечниковый индексы) не отличались от таковых у интактных животных. Аналогичная картина наблюдалась и в группе животных, получавших масляный раствор альфа-токоферола в дозе 0,5 мг/кг.

Цитограмма бронхоальвеолярной лаважной жидкости (по общему числу клеток и дифференциальному составу) во всех исследованных группах соответствовала норме.

При исследовании культуры альвеолярных макрофагов, выделенных из лаважной жидкости крыс, получавших на протяжении 14 дней "Липовитам E" в дозе 0,5 мг/кг, показано, что реакция на экзогенную стимуляцию носила отсроченный характер: пик хемолюминесценции возникал на 4-5 мин (а не на 1-й, как в контроле) и имел меньшую амплитуду. На протяжении последующих минут наблюдения сохранялся повышенный уровень продукции свободных радикалов. Альвеолярные макрофаги животных, получавших "Липовитам E" в дозе 0,01 мг/кг, характеризовались более высоким уровнем спонтанной оксидантной активности, а реакция на стимуляцию FMLP была резко выраженной - возникала на 1-й мин, но уже к 3-4 мин наблюдения уровень продукции свободных радикалов возвращался к исходному. После двухнедельного введения крысам масляного раствора витамина E (0,5 мг/кг) в ответной реакции альвеолярных макрофагов на стимулятор оксидантного взрыва не удалось выявить какой-либо закономерности: реакция носила нестабильный, разнонаправленный характер. Значения спонтанной оксидантной активности клеток также отличались большим диапазоном (от 1,8 до 8,0 мВ). Отсутствие закономерных изменений в функциональной активности макрофагов крыс, получавших масляный раствор альфа-токоферола, может быть обусловлено плохим всасыванием препарата в кишечном тракте и связанными с этим значительными индивидуальными различиями в дозах альфа-токоферола, реально воздействующих на клетки организма в каждом конкретном случае. "Липовитам E" лишен этого недостатка благодаря приобретаемой им при растворении в биологических жидкостях липосомальной форме, обеспечивающей хорошую всасываемость препарата.

В) Влияние "Липовитама E" на формирование кальциевого сигнала в перитонеальных макрофагах крысы.

Прямое действие "Липовитама E" исследовано на перитонеальных макрофагах, окрашенных флуоресцентным зондом Фура-2, позволяющим измерять концентрацию свободных ионов кальция в цитоплазме (цитозоле). Через 3-5 с после внесения в среду инкубации "Липовитама E" (в концентрации по витамину E 5,0 мкг/мл) происходит небольшое (до 200 нМ) и кратковременное (15-20 с) повышение внутриклеточной концентрации ионов Ca²⁺. Это свидетельствует об очень быстром проникновении препарата в клетки, по крайней мере, в их плазматическую мембрану, являющуюся рецепторной зоной формирования Ca-сигнала. В условиях бескальциевой среды (устранение ионов Ca²⁺ из среды инкубации макрофагов) наблюдались те же изменения внутриклеточной концентрации ионов Ca²⁺, что свидетельствует о том, что отмечаемый подъем концентрации свободного кальция в клетке связан с мобилизацией ионов Ca²⁺ из внутриклеточных депо, а не с входом кальция из наружной среды. Аналогичная реакция была зарегистрирована и при использовании большей концентрации "Липовитама E" (12,8 мкг/мл, рис. 1а, б).

Следует отметить, что такое же действие оказывали и липосомы, не содержащие витамин E (рис. в). На основании этого наблюдения можно заключить, что обнаруженный эффект определяется, скорее всего, ненасыщенными жирными кислотами, входящими в состав фосфолипидов липосом и способными, как известно, вызывать мобилизацию ионов Ca²⁺ из внутриклеточных депо и активировать мембраносвязанный фермент Ca-ATФазу, ответственную за откачку ионов Ca²⁺ из цитоплазмы и поддержание постоянства концентрации ионов Ca²⁺ внутри клетки. Последнее чрезвычайно важно для осуществления ионами кальция их функции вторичного посредника в запуске и регуляции важнейших физиологических реакций клетки.

Таким образом, проведенные исследования показали:
а) отсутствие токсических проявлений применения препарата "Липовитам E" в дозе 0,5 мг/кг ежедневно в течение 14 дней;
б) достоверный значительный антиоксидантный эффект "Липовитама E", проявившийся в снижении продукции свободных радикалов альвеолярными макрофагами в ответ на экзогенный стимулятор;
в) формирование определенного антиоксидантного резерва макрофагов при длительном применении "Липовитама E", что проявляется в отсроченной реакции оксидантного взрыва на действие экзогенного стимулятора и меньшей выраженности этой реакции. Данный эффект не отмечен при использовании масляного раствора витамина E;
г) увеличение антиоксидантного потенциала клеток позволяет снизить риск вторичного повреждения тканей свободными радикалами при сохранении в пределах нормы поглотительной способности макрофагов (фагоцитарное число 36,5 ± 2,2%, фагоцитарный индекс 3,43 ± 0,26);
д) липосомальная форма "Липовитама E" позволяет препарату очень быстро проникать в клетки, по крайней мере, в поверхностную плазматическую мембрану. На этом основании можно предполагать, что происходит быстрое связывание молекул альфа-токоферола с мембранными структурами, увеличивающее его антиоксидантную эффективность и антиоксидантный потенциал клеток;
е) использование "Липовитама E" может иметь важное значение в профилактике оксидантных повреждений клеток и тканей, вызванных различными факторами.

Формула изобретения

1. Субстанция, обладающая антиоксидантной активностью, включающая альфа-токоферол ацетат, фосфолипиды или фосфатиды при следующем соотношении ингредиентов, мг/г:
Альфа-токоферол ацетат - 10 - 90
Фосфолипиды или фосфатиды - 20 - 180
2. Витаминный комплекс, содержащий субстанцию, включающую альфа-токоферол ацетат, фосфолипиды или фосфатиды, характеризующийся тем, что он представляет собой таблетированную форму, при этом он дополнительно содержит магний карбонат основной, крахмал картофельный, кальций стеариновокислый и микрокристаллическую целлюлозу при следующем соотношении компонентов, г на 1 таблетку массой 0,3 - 0,5:
Альфа-токоферол - 0,0017 - 0,015
Фосфолипиды или фосфатиды - 0,003 - 0,030
Магний карбонат основной - 0,04 - 0,10
Микрокристаллическая целлюлоза - 0,02 - 0,10
Крахмал картофельный - 0,004 - 0,05
Кальция стеариновокислый - 0,002 - 0,01
3. Витаминный комплекс по п.2, отличающийся тем, что он дополнительно содержит бутилоксионизол в количестве 0,000034 г.

4. Витаминный комплекс по п.2 или 3, отличающийся тем, что он содержит фосфатиды семян подсолнечника, или фосфолипиды соевые, или подсолнечника.

5. Витаминный комплекс по любому из пп.2 - 4, отличающийся тем, что в качестве сорбента он содержит сорбит, и/или сахарную пудру, и/или соль поваренную, и/или ксилит пищевой, и/или маннит, и/или лактозу.

РИСУНКИ

Рисунок 1