Способ определения белков

 

Изобретение относится к биологии, в частности к биохимии и молекулярной биологии, и может найти применение в экспериментальной и клинической медицине. Сущность изобретения: нитроцеллюлозную мембрану разбивают на ячейки (до 1000) размером 3-5 мм. Ячейки маркируют в 2-х координатах, в середину каждой ячейки мембраны наносят определенные антитела к разным белкам по одному виду антител в ячейку, иммобилизуют их, а после отмывки мембраны наносят на нее предварительно меченые белки в пробе. Выдерживают в течение 1-2 ч и отмывают мембрану от несвязавшихся белков. Содержание белков определяется радиографически. Идентификацию белков осуществляют по номеру ячейки (антителу). 6 з.п.ф-лы.

Изобретение относится к биологии, в частности к биохимии и молекулярной биологии, и может найти применение в различных отраслях промышленности и науки.

Широко известны различные методы разделения белков, основанные на различии молекул по размеру: это диализ, ультрафильтрация, центрифугирование и гель-хроматография, электрофорез и ионообменная хроматография.

На биоселективном взаимодействии с лигандами, фиксированными на носителе, основано разделение белков с помощью афинной хроматографии. Взаимодействие белка с лигандом облегчается встраиванием между лигандом и матрицей гибкой "ножки". В качестве матрицы применяются агароза, пористое стекло, целлюлоза, сшитые декстрины и др. Афинная хроматография нашла широкое применение при разделении белков (Х.- Д. Якубке, Х.Ешкайт "Аминокислоты. Пептиды. Белки", М., Мир, 1985, с. 345-356).

Наиболее близким к изобретению является способ определения белков с использованием иммобилизованных антител против данного белка, включающий иммобилизацию антител на сорбенте, отмывку сорбента, забивку мест неспецифического связывания на сорбенте, нанесение пробы, содержащей предварительно меченые белки, на иммобилизованные на сорбенте антитела, выдержку в течение времени, достаточного для взаимодействия антител с белками, отмывку сорбента от несвязавшихся белков и идентификацию белков методом радиографии (Т. Чард. Радиоиммунологические методы. М., Мир, 1981, с. 126-127).

Недостатками указанных способов являются сложность осуществления, использование дорогостоящего стационарного оборудования и, соответственно, невозможность проведения исследований в полевых условиях, в условиях космического полета и малых клиниках, использование большого количества разных реактивов, включая вредные и канцерогенные, ограниченная возможность одновременного определения содержания разных белков в одной пробе.

Техническим результатом заявленного способа является устранение вышеуказанных недостатков и возможность определять одновременно большое количество разных белков (до 1000 видов) в одной пробе при одновременном обеспечении количественного сравнения содержания белков в пробе и сохранения наглядного визуального результата анализа на длительное время.

Для достижения указанного технического результата в способе определения белков, включающем иммобилизацию антител, отмывку, забивку мест неспецифического связывания, нанесение пробы, содержащей предварительно меченые белки, на иммобилизованные антитела, выдержку в течение времени, достаточного для взаимодействия антител с белками, отмывку от несвязавшихся белков и идентификацию белков, иммобилизацию антител осуществляют на мембране, которую предварительно разбивают на ячейки, и в середину каждой ячейки наносят антитела к разным белкам по одному виду антител в ячейку, после отмывки мембраны, забивки мест неспецифического связывания на мембране, нанесения пробы на иммобилизованные на мембране антитела, выдержки и отмывки мембраны от несвязавшихся белков определяют количество белка, связавшегося с каждым видом антител.

Кроме того, идентификацию белков осуществляют по антителу в соответствующей ячейке, а количество белка в ячейке могут определять методом радиографии или хемилюминесцентным методом.

Кроме того, можно использовать нитроцеллюлозную мембрану, а в качестве жидкости для забивки мест неспецифического связывания используют молоко порошкообразное 5%-ной концентрации или TWIN-20.

Помимо нитроцеллюлозной мембраны можно также использовать и другие мембраны для иммобилизации белков, например активированную бумагу или активированный нейлон.

Сущность изобретения поясняется на примере.

Пример. Способ осуществляется следующим образом. Вся площадь нитроцеллюлозной мембраны разбивается на ячейки, например, размером 3-5 мм. Количество ячеек на одной мембране может достигать 1000 и выше. Каждая ячейка маркируется с помощью цифровых и буквенных координат. В середину каждой ячейки наносят и иммобилизуют антитела к разным белкам по одному виду антител в одну ячейку. Диаметр пятна нанесенных антител составляет ~ 3 мм. После этого осуществляют забивку мест неспецифического связывания на мембране порошкообразным молоком 5%-ной концентрации или TWIN- 20. На следующем этапе на иммобилизованные антитела наносят пробы, содержащие меченые радиоактивной меткой белки. Далее, например, через 1-2 часа, в течение которых происходит взаимодействие белков со специфическими антителами, производят отмывку мембраны от несвязавшихся белков пробы. На мембране в конкретной ячейке остаются только белки, связавшиеся со своими антителами. Дальше определяют количество белка, связавшегося с каждым типом антител, с помощью стандартных методов подсчета радиоактивности счетчиком или радиографии на рентгеновской пленке, накладываемой на мембрану, с последующим денситометрированием.

В случае использования люминесцентной метки накладывают на мембрану пленку и определяют количество белка хемилюминесцентным методом.

Заявленный способ обеспечивает удобство документирования результатов анализа в виде мембраны с наложенным на нее регистрирующим покрытием (пленкой) с пятнами, параметры которых (размеры, плотность) позволяют осуществить количественное сравнение содержания различных белков в пробе.

Формула изобретения

1. Способ определения белков, включающий иммобилизацию антител, отмывку, забивку мест неспецифического связывания, нанесение пробы, содержащей предварительно меченые белки, на иммобилизованные антитела, выдержку в течение времени, достаточного для взаимодействия антител с белками, отмывку от несвязавшихся белков и идентификацию белков, отличающийся тем, что иммобилизацию антител осуществляют на мембране, которую предварительно разбивают на ячейки, и в середину каждой ячейки наносят антитела к разным белкам по одному виду антител в ячейку, после отмывки мембраны, забивки мест неспецифического связывания на мембране, нанесения пробы на иммобилизованные на мембране антитела, выдержки и отмывки мембраны от несвязавшихся белков определяют количество белка, связавшегося с каждым видом антител.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что идентификацию белков осуществляют по антителу в соответствующей ячейке.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что количество белка в ячейке определяют методом радиографии.

4. Способ по пп.1 - 3, отличающийся тем, что используют нитроцеллюлозную мембрану.

5. Способ по пп. 1 - 4, отличающийся тем, что в качестве жидкости для неспецифического связывания используют молоко порошкообразное 5%-ной концентрации или TWIN-20.

6. Способ по пп.1 - 5, отличающийся тем, что мембрану разбивают на ячейки размером 3 - 5 мм и маркируют их в двух координатах.

7. Способ по пп.1 - 6, отличающийся тем, что указанную выдержку осуществляют в течение 1 - 2 ч.