Способ определения состояния печени

 

Изобретение относится к медицине. Способ определения состояния лечения субъекта содержит измерение уровня изоформы пиглутатионовой S-трансферазы (πGST) в образце биологической жидкости субъекта посредством иммуноанализа, специфичного для изоформы πGST, сравнение измеренного уровня πGST c нормальным диапазоном πGST в биологической жидкости и при определении повышенного уровня πGST относительно нормального диапазона определение состояния печени субъекта на основании уровня πGST в биологической жидкости. Способ имеет особо важное значение для случаев трансплантации печени, так как позволяет определить возможность отторжения на очень ранней стадии после трансплантации, поскольку первичное отторжение трансплантата обычно возникает в билиарном дереве. 2 c. и 9 з.п. ф-лы, 5 табл., 7 ил.

ОБЛАСТЬ НАЗНАЧЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ Это изобретение относится к способу определения состояния печени субъекта, включая реципиента с трансплантированной печенью, и соответствующего выбора терапевтического или корректирующего воздействия, если это требуется, в зависимости от указанного состояния печени.

УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ Возможность определения различных видов повреждений печени имеет огромное значение для лечения как пациентов с пересаженной печенью, так и больных, страдающих другими заболеваниями печени, которые могут влиять на билиарную систему.

Глутатионовые S-трансферазы (GSTs) содержат мультигенное семейство белков, состоящих, в основном, из изоформ класса альфа (αGST), мю (μGST), пи (πGST) и тета (ΘGST), как определяемых изоэлектрической точкой, и реагируют на детоксикацию ряда ксенобиотиков, в основном, посредством конъюгирования с глутатионом (Beckett, G.J. and Hayes, J.D., Advances in Clinical Chemistry (1993); 30, 281-380). Обычно эти белки являются димерными по природе, состоящими из двух субъединиц 25-27 kDa, и могут существовать в виде гомодимерных или гетеродимерных форм. Пи-глутатионовая S-трансфераза (πGST) является гомодимером и располагается в цитоплазме эпителиальных клеток желчных протоков в печени (Beckett G.J. and Hayes, J.D., (1993), см. выше). Известно, что αGST присутствует в гепатоцитах в печени и существует как в гомодимерном, так и в гетеродимерном состоянии (Campbel, J.A.H., et al., Cancer (Philadelphia) (1991) 67, 1608-1613; Howie, A.F., et al., Clin. Chem. Acta., (1988) 177, 65-76). Это гетерогенное GST-распределение α- и πGST предполагает, что различные изоферменты имеют уникальные функции in vivo в различных участках печени (Campbell, J.A.H., et al., (1991), см. выше).

В материалах ЕР-А 0 640 145 описан способ, который способствует ранней диагностике отторжения трансплантированной печени в организме реципиента и который содержит измерение увеличения αGST плазмы или сыворотки реципиента (О в отсутствии или до начала каких-либо изменений в трансаминазе плазмы или сыворотки. Таким образом, было убедительно продемонстрировано, что измерение уровня αGST плазмы облегчает мониторинг пост-трансплантационного состояния печени вследствие своего действия в качестве чрезвычайно чувствительного, хотя и не полностью специфичного маркера отторжения трансплантанта.

Примечательно, что πGST не уделялось никакого внимания как потенциальному маркеру отторжения трансплантанта, возможно, вследствие низких уровней присутствия фермента в билиарных эпителиальных клетках печении. Существует, однако, свидетельство того, что α- и πGST присутствуют в желчи как здоровых людей, так и людей, страдающих конкретными раковыми заболеваниями (например, холангиокарциномой), и могут быть измерены при помощи радиоиммуноанализа (Howie, A. F. , et al., Clin. Chem. Acta. (1989) 184, 269-278). Кроме того, некоторые авторы приводят тот факт, что измерение уровней πGST сыворотки и плазмы может облегчать диагностику злокачественных опухолей, поскольку оказывается, что πGST является специфично выраженной в злокачественной ткани (Niitsu, Y. , et al., Cancer (1989) 63, 317-323; Howie, A.F., et al., Clin. Chem. (1990) 36(3), 453-456, and Hida, Т., Cancer (1994) 73(5), 1377-1382. Ни один из вышеуказанных авторов не ссылается на тот факт, что πGST может прогнозировать отторжение трансплантированной печени или другие билиарные нарушения или нарушения в печени.

Поскольку известно, что первичное отторжение трансплантанта обычно происходит в билиарном дереве в печени (Ascher, N., (1993) In 'Immunology of liver transplantation' Neuberger, J. and Adams, D. (eds)), вероятно, что конкретное измерение уровней билиарной или плазменной πGST может обеспечить диагностику раннего отторжения или облегчить распознавание различий между пост-трансплантационными нарушениями в клетках печени или желчи. Важность способности к различению между неспецифичным повреждением печени и отторжением трансплантанта трудно переоценить, так как лечение в каждом из состояний будет различным. Более того, неправильно начатое лечение может сильно ухудшить состояние здоровья пациента, который и так серьезно болен. Например, если отторжение трансплантанта происходит вследствие вирусной инфекции (например, реинфекции Гепатита С или цитомегаловируса (CMV), необходимо тщательно следить за стадиями лечения антиотторгающей иммуносупрессией, так как чрезмерное количество иммуносупрессивных веществ (например, циклоспорина А или FK506) будет значительно снижать способность к сопротивлению вирусной инфекции. И наоборот, неспособность к отличию истинного отторжения от неспецифичного повреждения трансплантанта может привести к задержке в применении иммуносупрессивной терапии и, в конце концов, к удалению трансплантанта.

Соответственно, существует необходимость в способах определения состояния печени индивидуума при различных заболеваниях или патологических состояниях печени.

СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ Изобретение представляет способ определения состояния печени субъекта, содержащий измерение уровня изоформы пи-глутатионовой S-трансферазы (πGST) в образце биологической жидкости указанного субъекта путем иммуноанализа, специфичного для изоформы πGST, сравнение измеренного уровня π с нормальным диапазоном πGST в указанной биологической жидкости, и, при обнаружении повышенного уровня πGST относительно указанного номального диапазана, определение состояния печени субъекта на основании уровня πGST в указанной биологической жидкости.

Выполнение другого способа определения состояния печени на основании маркера, специфичного для конкретного участка печени, значительно облегчает лечение больных в случае различных заболеваний и других патологических состояний печени, как будет более подробно описано ниже.

Субъектом является соответствующий реципиент с трансплантированной печенью, а состояние печени определяется как пост-трансплантационное.

Изобретение имеет особенно большое применение в случае трансплантации печени, так как оно позволяет определить возможность отторжения на очень ранней стадии пост-трансплантационного периода, потому что первичное отторжение трансплантанта происходит обычно в билиарном дереве в печени, как указано выше. Соответственно, в соответствии с данным изобретением, возможно даже еще более раннее определение отторжения трансплантированной печени по сравнению со способом, описанным и заявленным в ЕР-А 0640145.

Предпочтительно, реципиентом является человек.

Иммуноанализ, предпочтительно, представляет собой иммуноферментный анализ, а более конкретно - анализ иммуноферментным сэндвичем.

Способ по данному изобретению может быть использован для измерения πGST в различных средах, но особенно в желчи, плазме и сыворотке.

Под биологической жидкостью здесь имеются в виду, например, жидкости в теле, такие, как желчь, плазма, сыворотка и моча, а также стабилизирующие ткань среды и перфузаты. Биологические среды здесь также называют обычно матрицами.

Способ по данному изобретению облегчает, прежде всего, определение изоферментного уровня πGST в желчи.

Если биологической жидкостью является желчь, нормальный уровень πGST составляет менее 15 мкг/л.

Если биологической жидкостью является плазма, нормальный уровень πGST составляет менее 100 мкг/л.

Как будет показано ниже, требуется особая осторожность, если способ применяется для плазмы, чтобы плазма собиралась и хранилась в присутствии антикоагулянта до процедуры определения при условиях, которые, в сущности, не допускают гемолиз в указанный период хранения.

Было обнаружено, что вследствие использования фторооксилатных пробирок имеет место высокая степень гемолиза, высвобождающего πGST из эритроцитов, что приводит к ложным показаниям повышенного уровня πGST. Другие изоферменты GST либо не обнаружены в крови, либо присутствуют на крайне низких уровнях. Например, μGST присутствует в лейкоцитах. Однако из литературы не ясно, присутствует ли она в эритроцитах. μGST присутствует в любом случае только в 50% популяции. ΘGST выражает такое же интериндивидуумное разнообразие, как и μGST, и если присутствует в крови, то присутствует на крайне низких уровнях. αGST не присутствует в крови в сколько-нибудь высокой степени.

В предпочтительном варианте осуществления изобретения образец разбавляется разбавителем, который содержит эффективное количество белка, оптимизирующего антитело-антигенные реакции.

Было обнаружено, что если разбавитель включает в себя Tween 20, обычно используемый как стандартный реагент в таких иммунометрических способах, определяется неправильная концентрация πGST. Если если использовать эффективное количество белка, который оптимизирует антитело-антигенные реакции, можно достичь линейного титрирования, как показано в Примере 6.

Белок может быть альбумином сыворотки, например альбумином бычьей сыворотки или альбумином сыворотки человека.

Способ иммуноанализа по данному изобретению может быть завершен в пределах 2,5 часов, как будет описано ниже в Примерах. Это значительно быстрее, чем любой промышленно доступный анализ на количественное определение πGST. Таким образом, в одном своем варианте изобретение представляет иммуноанализ, способный завершиться в пределах 2,5 часов, который основан на последовательном добавлении образца, антитело-ферментного конъюгата и субстрата в лунки на микротитровальном планшете или другой поверхности, покрытой моноклональным анти-πGST IgG. Полученная в результате интенсивность окраски пропорциональна количеству πGST, присутствующему в образце, а диапазон определения при анализе составляет 0-100 мкг/л. Диапазон при анализе легко увеличивается при помощи повышенного разбавления образца.

В соответствии с другим вариантом изобретения, дополнительно измеряется уровень изоформы альфа-глутатионовой S-трансферазы (αGST) в образце биологической жидкости указанного субъекта, чтобы облегчить определение различия между отторжением трансплантанта и неспецифическим поражением клеток печени указанного субъекта.

Изобретение также представляет комплект или набор для проведения анализа, содержащий один или более компонентов для осуществления способа в соответствии с вышеизложенным.

КРАТКОЕ ОПИСАНИИ ЧЕРТЕЖЕЙ Фиг. 1 представляет собой схематическое изображение проведения анализа иммуноферментным сэндвичем по Примеру 1; фиг. 2 представляет собой график оптической плотности при 450/630 nm по отношению к log концентрации πGST (мкг/л) в соответствии с иммуноферментным анализом на человеческую πGST, описанным в Примере 1; фиг. 3 представляет собой анализ SDS-PAGE человеческой μ-,α- и πGST; фиг. 4 представляет собой анализ человеческой πGST методом иммуноблоттинга; фиг. 5 представляет собой график содержания αGST и πGST (нг/мл) в желчи по времени после реперфузии (в часах) для ряда больных;
фиг. 6 представляет собой график концентрации πGST по времени (в днях) для ряда больных;
фиг. 7 представляет собой график AST/ALT (U/L) и αGST и πGST и (нг/мл) по дням после трансплантации для одного больного.

ВАРИАНТЫ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ
Далее изобретение будет проиллюстрировано на следующих примерах.

Пример приготовления A
Очистка человеческой πGST
πGST была очищена от плаценты человека посредством аффинной хроматографии. Ниже приведены точные данные по процедуре очистки:
a. 325 r плаценты человека гомогенизировали в течение 2 минут в буфере гомогенизации при соотношении одной части плаценты к трем частям буфера, используя гомогенизатор Уоринга (Waring) (Waring - марка). Буфер гомогенизации имел следующий состав:
20 mM Tris-HCI
250 mM сахарозы
5mМ EDTA pH 7.8
2 мкг/мл лейпептина
2 мкг/мл пепстатина
b. Гомогенат плаценты центрифугировали при 10000 g в течение 60 минут.

c. Супернатант затем нанесли на аффинную колонку с глутатионовой (GSH)-сефарозой, предварительно уравновешенную в 20 mM Tris-HCl с 200 mМ NaCI, pH 7.8. Уравновешивающий буфер нанесли повторно, чтобы элюировать несвязанный белок. Наконец, 50 mM Tris- HCI pH 9.5, содержащий 5 mM GSH, использовали, чтобы элюировать связанную GST из аффинной колонки.

d. Элюированный материал затем подвергали диализу с 0,1М PBS.

Пример приготовления В
Получение и очистка антител:
Очищенную человеческую πGST подкожно (s.c.) инъецировали новозеландским белым кроликам в соответствии с временной схемой, приведенной ниже, и провели оценку сыворотки на анти-πGST реактивность. Поскольку было достаточно, что титр lgG [античеловеческая πGST] определен полуколичественным дот-блот анализом, животные были обескровлены, и сыворотка собрана. Весь lgG очистили от кроличьей сыворотки посредством аффинной хроматографии белка A и использовали для конъюгации с пероксидазой хрена (HRP). Моноклональный lgG [античеловеческая πGST] как асцит был получен из университетской больницы в Nijmegenen, Нидерланды, и не очищался перед использованием.

Схема иммунизации (общая).

День 1: При опытном кровотечении из уха кролика взяли 5 мл пресыворотки. 0,5 мл (100 мкг) антигена человеческой πGST смешали с равным объемом полного адъюванта Фрейнда. Смесь антигена и адъюванта была гомогенизирована для обеспечения хорошей эмульсии. Затем эту смесь инъецировали подкожно в множество мест на предварительно выбритой спине кролика.

День 28: При опытном кровотечении из уха кролика взяли 5 мл сыворотки.

0,5 мл (100 мкг) антигена смешали с равным объемом неполного адъюванта Фрейнда. Смесь антигена и адъюванта была гомогенизирована для обеспечения хорошей эмульсии. Затем эту смесь инъецировали подкожно в множество мест на спине кролика.

День 42: При опытном кровотечении из уха кролика взяли 10 мл крови.

День 56: Вторую бустер-инъекцию сделали кролику, как описано для дня 28.

День 70: При опытном кровотечении из уха кролика взяли 10 мл крови. Когда титр был достаточно высоким, кролика умертвили и собрали максимально возможное количество крови.

Пример приготовления С
Иммуноблоттинг:
Все поликлональные и моноклональные lgG для использования в следующих примерах проверили на πGST реактивность и потенциальную перекрестную реактивность па отношению к человеческой α- и μGST, соответственно, при помощи следующих составов иммуноблота:
(а) Кроличий lgG [античеловеческая πGST] использовали для зондирования нитроцеллюлозных мембран, содержащих иммобилизованную человеческую α,π- и μGST.
(b) Мышиный lgG [античеловеческая πGST] использовали для зондирования нитроцеллюлозных мембран, содержащих иммобилизованную α-,π- и μGST.

Для определения иммуноблота использовали следующий способ:
1. Человеческую α-,π- и μGST (0,5 мкг/след) подвергали электрофорезу на 15% SDS-PAGE с маркерами молекулярного веса, которые также были включены.

2. После электрофореза полиакриламидный гель срезали, и одну половину окрасили для белка, а другую использовали для электрофорезного переноса на нитроцеллюлозу.

3. После электрофорезного переноса нитроцеллюлозные мембраны были блокированы на 1 час с 5%(w/v) Marvel (Marvel - торговая марка) в забуфренном фосфатом физиологическом растворе, содержащем 0,05% (w/v) TWEEN-20 (PBST)- блокирующий буфер.

4. Затем приготовили следующие растворы:
(i) Кроличий lgG [античеловеческая πGST] в 1 % (w/v) Marvel в PBST
(ii) Мышиный lgG [античеловеческая πGST] в 1% (w/v) Marvel в PBST
и добавили их в мембраны, когда блокирующий буфер был слит.

Инкубирование с растворами антител допускали в течение одного часа.

5. Нитроцеллюлозные мембраны промывали затем в PBST (2х по 5 минут каждую).

6. Затем приготовили конъюгат антикроличьей lgG-HRP (1/1000 в 1% (w/v) Marvel в PBST и добавили к 4(i) (см. выше). Приготовили также конъюгат антимышиной lgG-HRP (1/1000) и добавили к 4(ii) (см. выше).

7. После инкубирования в течение одного часа с антивидовыми конъюгатами реагенты удалили, а мембраны промыли как указано выше в п.5.

8. Затем приготовили диаминобензидиновый субстрат и добавили в мембрану.

О положительной реакции свидетельствовал коричневый осадок на нитроцеллюлозной мембране.

Пример приготовления D
Синтез конъюгата пероксидазы IgG-хрена анти-πGST:
Конъюгаты анти-πGST lgG-HRP синтезировали при использовании метода конъюгации тиоэфира (Duncan, R.J.S., et. al., (1983); Anal. Biochem. 132, 68-73). Реакционноспособные группы имида малеиновой кислоты наносили на молекулы lgG при использовании SMCC (сукцинимидил 4-(N-малеимидометил) циклогексан 1-карбоксилат), и замаскированные сульфидрильные группы связывались с HRP. После стадии демаскировки, для получения реакционноспособных сульфидрильных групп, lgG, активированный имидом малеиновой кислоты, и HRP-SH смешали вместе и допустили проведение реакции в течение 4,5 часов. Полученный в результате конъюгат lgG-HRP, образованный ковалентной тиоэфирной связью, внесли в 50% (v/v) глицерол и хранили при -20^oC для использования в EIA Примера 1.

Пример 1
Анализ иммуноферментным сэндвичем
Формой иммуноанализа на количественное определение человеческой πGST является обычная форма сэндвича, как схематически представлено на фиг. 1 и описано ниже.

а. Титрационный микропланшет Nunc Maxisorp (Nunc Maxisorp - торговая марка) был покрыт мышиным моноклональным lgG [античеловеческая πGST] (приведенным в Примере приготовления В), иммобилизованным посредством козлиных F(ab)₂-фрагментов [антимышиный lgG]. Этот способ покрытия антителами служит для ориентации Mab-связывающих сайтов, а также повышает чувствительность анализа посредством сведения к минимуму обусловленной адгезией денатурации иммобилизованного антитела.

b. Человеческую πGST, очищенную от плаценты как описано в Примере приготовления A, использовали в качестве калибровочного маркера анализа.

c. Конъюгаты lgG [античеловеческая πGST]-HRP, совместно с тетраметилбензидиновым субстратом (TMD), использовали для облегчения определения иммобилизованной πGST.
d. Ферментная реакция была остановлена добавлением 1 N H₂SO₄, и оптическую плотность измерили при 450 nm, используя 630 nm в качестве опорной длины волны. Интенсивность цвета была пропорциональна концентрации πGST, и после построения графика A_{450/630 nm} относительно концентрации (мкг/л) могла быть определена концентрация неизвестных образцов (см. фиг. 2). Общее время анализа составило менее 2,5 часов.

Было установлено, что общее время анализа составило 2 часа 15 минут, и условия анализа включали в себя встряхивание титрационного микропланшета при постоянной температуре во время стадий инкубирования образца и конъюгата, соответственно. При инкубировании субстрата TMB требовалась только постоянная температура.

Пример 2
Сбор плазмы для анализа πGST
Было исследовано влияние различных обычно используемых антикоагулянтов (этилендиаминтетрауксусная кислота (EDTA), литиевый гепарин, цитрат натрия и фторооксилат) и других пробирок для сбора плазмы (содержащих ингибиторы тромбоцитов) на уровни πGST в плазме. Образцы собрали посредством венепункции в пробирки, содержащие определенный антикоагулянт. Плазму отделили центрифугированием (6000g в течение 10 минут), и оставшиеся тромбоциты удалили посредством дополнительной стадии центрифугирования (10000g в течение 10 минут). Супернатант удалили, и образцы подвергли анализу, используя схему, описанную в Примере 1.

Плазму собрали у нескольких индивидуумов в ряд пробирок для сбора плазмы. Каждый образец обработали в соответствии с описанным выше, и выход πGST в плазму наблюдался в течение более 24 часов. В Таблице 1 (см. ниже) показаны уровни πGST в плазме тех же индивидуумов, собранной в четыре различные пробирки для сбора плазмы, подвергнутые анализу при Т0 и Т24. Результаты показывают, что не существует значительной разницы в концентрациях πGST плазме, собранной в присутствии любого из указанных антикоагулянтов. Не наблюдается значительного повышения концентраций πGST (вследствие выхода π из эритроцитов или тромбоцитов), когда неотделенная плазма хранится в течение до 24 часов. Исключение составляют фторооксилатные пробирки, где наблюдается высокая степень гемолиза, когда πGST выходит из эритроцитов и имеют место ложные показания уровней белка, как показано в Таблице 1.

Из Таблицы 1 видно, что не существует существенной разницы между концентрацией πGST в плазме, собранной в присутствии любого из вышеуказанных антикоагулянтов.

Пример 3
Анализ чистоты реагентов иммуноанализа
Фиг. 3 иллюстрирует чистоту человеческой πGST, полученной в ходе Примера приготовления A перед иммунизацией кроликов и подтверждает отсутствие любых других белков человеческого происхождения, которые могли бы в противном случае способствовать снижению специфичности анализа. На фиг. 3:
Дорожка 1 = μGST
Дорожка 2 = αGST
Дорожка 3 = πGST
Дорожка 4 = маркеры молекулярного веса.

Иммуноблот анализ реакционной способности моноклонального антитела выявил, что lgG [античеловеческая πGST] был в высшей степени специфичным для человеческой πGST и не показал сколько-нибудь значительной перекрестной реактивности с человеческой α- или μGST. Результаты показаны на фиг. 4.

Дорожка 1 = πGST
Дорожка 2 = маркеры молекулярного веса.

Результаты, пoдтвepждающие отсутствие реакционной способности α- и μGST в специфичном для человеческой πGST иммуноферментном анализе, показаны в Таблице 2.

Из Таблицы 2 ясно, что никакой перекрестной реактивности не наблюдается в этом анализе ни для αGST, ни для μGST.
Значение этого факта чрезвычайно велико, поскольку это означает, что иммуноферментный анализ на количественное определение человеческой πGST является специфичным для определения человеческой πGST. Таким образом, любое присутствие человеческой πGST в образцах может быть специфично определено, в отличие от других GST, без контаминации в результате многократных манипуляций с образцом.

Пример 4
Количественное определение πGST в желчи
Несколько образцов желчи, взятых от пациентов со специфичными нарушениями печени и билиарными нарушениями, исследовали в ходе анализа на человеческую πGST. Было обнаружено, что у больных гепатоцеллюлярной карциомой (HCC) и первичным билиарным циррозом (PBC) были очень высокие уровни πGST. Больной с камнями в желчных протоках (BDS) также имел повышенные уровни πGST, но не такие высокие, как в случаях с HCC и PBC, как показано в Таблице 3. Все эти образцы показывают значительно повышенные уровни πGST.
Пример 5
Клиническая применимость количественного определения πGST
Ряд образцов желчи и плазмы собрали у больных после операции трансплантации печени и подвергли анализу на π- и αGST соответственно. У больных наблюдался обширный спектр постоперационных состояний, от выздоровления с гладким течением до острого отторжения и реинфекции Гепатита С, которые обычно связаны с трансплантацией.

При одновременном мониторинге π- и αGST наблюдался ряд существенных тенденций. αGST измерялась в соответствии с процедурой, описанной в EP-A 0640145. При выздоровлении с гладким течением πGST могла определяться уже через 2 часа после трансплантации, и уровни оставались низкими (т.е. ниже 50 мкг/л). Уровни αGST были первоначально высокими вследствие нарушения реперфузии, но вернулись к уровням базисной линии в течение двух дней, как показано на фиг. 5. На этом графике показано обычное изменение α- и πGST во время и после трансплантации печени человека. Уровни πGST остаются низкими. Осложнения, связанные с трансплантацией печени, также могут быть идентифицированы. Одной из самых больших опасностей является острое отторжение, или - еще более серьезное - стероидоустойчивое отторжение. Было обнаружено, что в этих конкретных случаях имело место значительное повышение уровней πGST на протяжении нескольких дней, как показано на фиг. 6. Этот график показывает уровни πGST во время случаев стероидоустойчивого отторжения (SR) и острого отторжения (AR). Уровни поднимаются и остаются высокими на протяжении примерно 20 дней. Уровни αGST были также высокими, но они возвратились к уровням базисной линии в течение 5-8 дней.

Возможность инфекции или реинфекции является другим серьезным риском, связанным с трансплантацией. Было обнаружено, что в случаях реинфекции HCV очень высокие уровни αGST наблюдались на протяжении значительного периода времени (т.е., как минимум, 25 дней). Однако уровни πGST оставались близкими к норме, как показано на фиг. 7. Это резко отличается от случаев острого отторжения, когда наблюдалось обратное. Таким образом, посредством одновременного количественного определения α- и πGST можно успешно определить различие между острым отторжением и реинфекцией HCV, что ранее было очень сложно и ставило хирургов, занимающихся трансплантацией, в затруднительное положение при выборе терапевтического воздействия.

Пример 6
Линейность разбавления образцов желчи
Был получен ряд образцов желчи от больных со специфическими нарушениями печени или билиарными нарушениями (гепатоцеллюлярная карциома и первичный билиарный цирроз), а также образцы донорской желчи и желчи после трансплантации печени. Эти образцы подвергли анализу на человеческую πGST в соответствии со схемой Примера 1.

Ряд стандартных разбавителей использовали в качестве разбавителей образцов для титрации образцов желчи. Эти разбавители обычно используются в способах проведения многих анализов, причем, Tween-20 является наиболее часто используемым детергентом. Было, однако, обнаружено, что присутствие этого конкретного детергента в разбавителе образца приводило к ошибочным результатам. Наблюдались ложные показания высокой концентрации πGST в образцах, разбавленных разбавителями с содержанием Tween-20, обусловленные недостаточной титрацией, как показано в Таблице 4. В отсутствие Tween-20 наблюдалась линейная титрация. Поэтому решающим фактором этого анализа является отсутствие Tween-20 (стандартного реагента) в разбавителе образца, так как при его использовании наблюдается ложное повышение уровней. Линейная титрация наблюдалась только в разбавителе без Tween-20.

Пример 7
Сравнение поликлональных и моноклональных антител как антител покрытия
Поликлональный и моноклональный lgG античеловеческой πGST были иммобилизованы на планшетах Nunc Maxisorp либо непосредственно, либо посредством линкера (F(ab)2- фрагментов козлиного антивидового lgG). Стандарты известных концентраций человеческой πGST затем обработали как описано в Примере 1, и сравнили оптические плотности при сходных концентрациях иммобилизованного lgG.

Как поликлональные, так и моноклональные антитела были нанесены на твердую фазу для использования в качестве иммобилизованного антитела. Результатом непосредственного покрытия поликлональными и моноклональными антителами были очень низкие показания оптической плотности для стандартной кривой (см. Таблицу 5). Когда иммобилизация была достигнута посредством линкерного антитела (козлиный антимышиный/антикроличий lgG), значительное увеличение значений O. D. было получено для моноклонального антитела. Однако никакого подобного увеличения не было получено для поликлонального антитела.

Непосредственное нанесение антитела на твердую фазу (2 мкг/мл) сравнивали с нанесением посредством линкерного антитела (козлиное антивидовое, при 2 мкг/мл) при постоянной концентрации антитела против πGST.

Формула изобретения

1. Способ определения состояния печени субъекта, заключающийся в том, что измеряют уровень изоформы пи-глутатионовой S-трансферазы (πGST) в образце биологической жидкости указанного субъекта посредством иммуноанализа, специфичного для изоформы πGST, сравнивают измеренный уровень πGST с нормальным диапазоном πGST в указанной биологической жидкости и, при определении повышенного уровня πGST относительно указанного нормального диапазона, определяют состояние печени субъекта на основании уровня πGST в указанной биологической жидкости.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что его проводят с субъектом, являющимся реципиентом с трансплантированной печенью, и состояние печени определяют после трансплантации.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что его проводят с человеком.

4. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что иммуноанализ представляет собой иммуноферментный анализ.

5. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что биологической жидкостью является желчь и нормальный уровень πGST составляет менее 15 мкг/л.

6. Способ по п.4, отличающийся тем, что биологической жидкостью является плазма и нормальный уровень πGST составляет менее 100 мкг/л.

7. Способ по п.6, отличающийся тем, что плазму собирают и хранят в присутствии антикоагулянта до процедуры определения при условиях, в сущности, не допускающих гемолиз в период хранения.

8. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что указанный образец разбавляют разбавителем, содержащим эффективное количество белка, оптимизирующего антитело-антигенные реакции.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что белком является альбумин сыворотки.

10. Способ по любому из предыдущих пунктов, отличающийся тем, что иммуноанализ проводят не более 2,5 ч.

11. Способ определения состояния печени субъекта, заключающийся в том, что измеряют уровень изоформы пи-глутатионовой S-трансферазы (πGST) в образце биологической жидкости указанного субъекта посредством иммуноанализа, специфичного для изоформы πGST, сравнивают измеренный уровень πGST с нормальным диапазоном πGST в указанной биологической жидкости и при определении повышенного уровня πGST относительно указанного нормального диапазона дополнительно определяют уровень изоформы α-глутатионовой S-трансферазы (αGST) и при повышенном уровне πGST в течение длительного периода времени и повышения уровня αGST в течение короткого времени определяют острое отторжение при трансплантации печени, а при обратных показателях - определяют реинфекцию НСУ.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12