Способ определения оптимальной химиотерапии пациентов, серопозитивных по вич, основанный на фенотипической лекарственной чувствительности человеческих штаммов вич

 

Изобретение относится к медицине. Сущность его состоит в том, что разработан способ определения оптимальной химиотерапии пациентов, серопозитивных по ВИЧ. Он состоит в том, что проводят трансфекцию линии клеток, восприимчивых к инфекции ВИЧ, нуклеотидной последовательностью, преимущественно кодирующей обратную транскриптазу и протеазу, из роl гена ВИЧ, выделенного у пациента, и сконструированной ДНК ВИЧ, из которой эта последовательность делетирована. Далее проводят культивацию трансфецированных клеток так, чтобы создать набор химерных вирусов, оценивают фенотипическую чувствительность химерных вирусов к ингибитору фермента, кодируемого роl геном ВИЧ, и определяют ее значение, конструируют набор данных, включающих величину чувствительности химерного вируса и соответствующую величину для химерного штамма ВИЧ дикого типа, отбирают оптимальный ингибитор на основании графического представления полученных таким образом данных. Технический результат: способ обеспечивает дешевое и быстрое получение большого объема фенотипической информации для индивидуальных ВИЧ-инфицированных пациентов. Способ практически применим ко всем доступным в настоящее время химиотерапевтическим режимам и, возможно, будет столь же применим к будущим химиотерапевтическим режимам. 3 с. и 21 з.п. ф-лы, 9 табл., 12 ил.

Область техники, к которой относится изобретение Изобретение относится к способу определения оптимальной химиотерапии пациентов, серопозитивных по вирусу иммунодефицита человека (ВИЧ), а также к приспособлению для определения клинического курса, предназначенному для использования врачами в лечении таких пациентов, основанным на фенотипической лекарственной чувствительности человеческих штаммов ВИЧ к ингибиторам одного или более ферментов pol гена ВИЧ, а также к способу одновременного определения фенотипической лекарственной чувствительности одного или более из ферментов pol гена ВИЧ к их ингибиторам.

Уровень техники К настоящему времени для лечения ВИЧ-инфицированных пациентов разработаны несколько химиотерапевтических режимов. Некоторые из этих режимов были разрешены для клинического применения, а клинические испытания других продолжаются. Можно предположить, что число разрешенных химиотерапевтических режимов в ближайшем будущем будет постоянно возрастать. Из-за появления в ходе терапии устойчивых к лекарствам вариантов ВИЧ расширяется применение комбинационной терапии, т. е. режимов лечения набором нескольких лекарств. Хотя было показано, что эти химиотерапевтические режимы влияют на вирусологические (вирусемия), иммунологические и клинические показатели ВИЧ-заболевания, практический опыт свидетельствует, что эти эффекты кратковременны. Более того, было обнаружено, что штаммы ВИЧ, которыми инфицирован отдельный пациент, быстро начинают проявлять пониженную чувствительность к лекарству или комбинации лекарств, которыми лечат данного пациента. Степень утраты эффективности химиотерапии может варьировать в зависимость от пациента, лекарства или комбинации лекарств. Установлено, что потеря эффективности определенных типов химиотерапии может быть связана с генотипическим характером аминокислотных изменений в геноме штаммов ВИЧ, заразивших пациента. Это, по-видимому, делает эти штаммы ВИЧ менее чувствительными к химиотерапии. Если ВИЧ-инфицированного пациента подвергать воздействию нескольких химиотерапевтических схем в течение длительных периодов времени, возникает более сложный характер аминокислотных изменений в геноме инфицирующих штаммов ВИЧ, что препятствует плодотворному продолжению лечения инфицированного пациента. Из вышесказанного понятно, что обычно можно установить генотипические изменения, происходящие в штаммах ВИЧ, подвергавшихся воздействию различных химиотерапевтических режимов, включающих применение одного или нескольких анти-ВИЧ лекарств. Однако пока несомненно, что из этих данных очень трудно получить информацию, позволяющую врачу, прописывающему химиотерапию, определить, имеет ли смысл начинать или продолжать определенный химиотерапевтический режим. Другими словами, генотипическую информацию, доступную в весьма ограниченном объеме, обычно невозможно перевести в фенотипическую информацию, позволяющую лечащему врачу однозначно определить, какая химиотерапия предпочтительна для данного пациента. Подобная проблема существует и для не получавших лекарства пациентов, инфицированных устойчивыми к лекарствам штаммами ВИЧ.

Мониторинг вирусемии становится обычным аспектом контроля ВИЧ. Однако на основе только показателя вирусемии невозможно решить, какие лекарства следует применять поодиночке или в комбинации.

Из химиотерапевтических режимов все чаще выбирают комбинационную терапию. Если при использовании комбинации лекарств исследовать неэффективность лекарств, оказывается невозможным определить, какое из лекарств в комбинации утратило активность. Невозможно просто заменить все лекарства из-за ограниченного количества доступных лекарств. Далее, если заменить весь химиотерапевтический курс, можно отбросить одно или несколько лекарств, активных для данного пациента. Кроме того, вирусы, устойчивые к определенному ингибитору, могут проявлять также в различной степени перекрестную устойчивость к другим ингибиторам.

Таким образом, в каждом случае, когда имеются результаты теста на вирусемию и зафиксировано возрастание вирусной нагрузки, в идеале следовало бы провести также тестирование лекарственной чувствительности/устойчивости. До тех пор, пока не определена эффективная исцеляющая терапия, для контроля за ВИЧ-заболеванием необходимо такое тестирование.

Существует общепринятый фенотипический метод, основанный на выделении вируса из плазмы в присутствии одноядерных клеток периферической крови донора (ОКПК) и последующем определении фенотипа указанных клеток (Japour A.J. а.о. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1993. V. 37. N 5. P. 1095-1101). Этот метод совместной культивации, который пропагандирует Группа клинических испытаний СПИД (ACTG) - особенно для фенотипирования устойчивости к азидотимидину (синоним зидовудина/ретровира, ретровир - товарный знак), требует много времени, дорог и слишком сложен для постоянного использования.

Фенотипический анализ рекомбинатных вирусов для оценки лекарственной восприимчивости изолятов ВИЧ типа I к ингибиторам обратной транскриптазы (ОТ) (reverse transcriptase - RT) был разработан Kellam P. and Larger B.A. (Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 1994. V. 38. N.1. P. 23-30). Этот метод позволяет создать жизнеспособный вирус путем гомологичной рекомбинации пула нуклеотидных последовательностей, кодирующих ОТ и полученных методом ПЦР, в неинфекционный провирусный клон с делецией по ОТ - pHIV Δ RTBstEII. Анализ для двух пациентов в ходе курса терапии зидовудином показал, что такой путь позволяет получить вирусы, обладающие в точности такими же генотипом и фенотипом, как и у ДНК исходных инфицированных лейкоцитов периферической крови. Однако этот способ включает в себя выделение вируса пациента путем совместной культивации плазмы или ОКПК пациента с ОКПК донора. Такая предварительная культивация вируса может исказить состав исходного вируса. К тому же этот способ, хотя и позволяет определить чувствительность изолятов к различным ингибиторам, но не предоставляет врачу информацию о том, следует ли продолжать существующий химиотерапевтический режим или же изменить терапию.

Кроме того, если изучают только один фермент pol гена, этот способ сам по себе не позволяет быстро получить текущую фенотипическую оценку комбинационной терапии, которая стандартно состоит в использовании одного ингибитора протеазы и двух ингибиторов ОТ.

Методика ПЦР (полимеразной цепной реакции) с фланкированием нуклеотидных последовательностей, используемая в анализе рекомбинантных вирусов, может привести к ситуации, когда рекомбинантный вирус не отражает в точности состояние штаммов ВИЧ, инфицировавших обследуемого пациента. Эта проблема сводится к гомологии последовательностей ДНК и к минимальной протяженности гомологии, необходимой для гомологичной рекомбинации в клетках млекопитающих (Rubnitz J. and Subramini S. Molecular and Cellular Biology. 1984. V. 4. N. 11. P. 2253-2258). Соответственно, любой фенотипический анализ, основанный на использовании рекомбинантного вируса, должен стремиться обеспечить максимально возможную амплификацию материала пациента и максимальную рекомбинацию.

Таким образом, применяемые способы выделения РНК и ПЦР с фланкированием последовательностей должны гарантировать такую амплификацию вирусного генетического материала, чтобы амплифицированный материал максимально отражал генетическое разнообразие вирусов у обследуемого пациента.

Следовательно, в текущей клинической практике имеется настоятельная потребность (а) в быстром и рутинном определении фенотипической лекарственной чувствительности штаммов ВИЧ, инфицировавших данного пациента, (б) в преобразовании полученных таким образом данных в легко трактуемую информацию и (в) в начале, продолжении или видоизменении на основе указанной информации предписанной указанным определенным пациентам химиотерапии.

Сущность изобретения В соответствии с первым аспектом изобретения предложен способ определения оптимальной химиотерапии ВИЧ пациентов, серопозитивных по ВИЧ, состоящий в трансфекции линии клеток, восприимчивых к инфекции ВИЧ, нуклеотидной последовательностью из pol гена ВИЧ, кодирующей желательный целевой фермент и полученной выделением вирусной РНК из образца биологического материала пациента и обратной транскрипцией необходимой области указанного pol гена, и сконструированной ДНК ВИЧ, из которой указанная последовательность делетирована, культивации указанных трансфецированных клеток, так чтобы создать набор химерных вирусов, оценке фенотипической чувствительности указанных химерных вирусов к ингибитору указанного фермента, кодируемого pol геном ВИЧ, и определении ее значения, конструировании набора данных, включающих в себя указанную величину для чувствительности химерных вирусов и соответствующую величину для химерного штамма ВИЧ дикого типа, повторении определения чувствительности по крайней мере еще для двух ингибиторов и конструировании таким образом в целом по крайней мере трех таких наборов данных, представлении указанных наборов данных в двумерной или трехмерной графической форме, так чтобы разница между чувствительностями химерного вируса и вируса дикого типа в случае каждого набора данных давала наглядную картину устойчивости химерного набора к воздействию данного ингибитора, и отборе оптимального ингибитора(ов) на основании графического представления измеренных таким образом устойчивостей.

Способ по настоящему изобретению экономично и быстро дает большой объем фенотипической информации для индивидуальных ВИЧ-инфицированных пациентов. Способ применим для всех находящихся в обращении доступных химиотерапевтических режимов, и ожидается, что он будет в такой же степени применим для будущих химиотерапевтических режимов.

Способ по настоящему изобретению предоставляет врачу фенотипические данные для штаммов ВИЧ пациента, которые можно немедленно использовать для определения того, следует ли начать, продолжить или видоизменить данный химиотерапевтический режим.

Предпочтительно наборы данных представляются на многоугольной или квазициркулярной диаграмме, включающей: (а) несколько нормализованных осей, выходящих радиально из начала координат, причем каждая ось соответствует одному набору данных или ингибитору или их комбинации; (б) оси, нормализованные таким образом, что величины чувствительности для ВИЧ дикого типа к различным ингибиторам равны на каждой оси, причем отсчеты данных представлены произвольно, и соединены с образованием правильного многоугольника, вершины которого лежат на осях, а центр которого задан началом координат.

(в) на каждой оси отложен отсчет, представляющий величину чувствительности набора химерных ВИЧ к ингибитору, соответствующему данной оси, причем отсчеты химерных данных соединены произвольным образом с образованием правильного или неправильного многоугольника, форма которого представляет устойчивость химерного набора к ряду ингибиторов.

Многоугольная или квазициркулярная диаграмма удобна тем, что устойчивость пациента к большому количеству лекарств характеризуется степенью различия между многоугольником, соответствующим набору химерных ВИЧ пациента, и многоугольником, соответствующим штамму дикого типа. Области многоугольников, как правило, расходятся в некоторых областях больше, чем в других, указывая в каждом случае на большую или меньшую степень устойчивости к ингибитору, чья ось проходит через данную область.

Таким образом, способ в соответствии с данным изобретением использует набор химерных ВИЧ и дает карту устойчивости этого набора по всему ряду ингибиторов. При таком способе карта или диаграмма дает техническую характеристику особенности химерного набора, которую нельзя получить обычными измерениями.

В предпочтительном осуществлении нормализованные оси располагаются под равными углами относительно друг друга.

Далее, предпочтительно каждая ось имеет логарифмическую шкалу.

Далее, предпочтительно, если в химерном многоугольнике представлены эксцентрические отсчеты данных, это указывает на ингибиторы, применение которых предположительно будет мало полезным или бесполезным для пациента, тогда как отсчеты данных, лежащие внутри или очень близко вне многоугольника дикого типа, указывают ингибиторы, применение которых будет существенно полезным для пациента.

Если для химерных ВИЧ и ВИЧ дикого типа представить наихудшие значения, то неправильный многоугольник, как правило, окружает многоугольники и химерный, и дикого типа. Смысл термина "эксцентрический", использованного выше, означает отсчет данных, лежащий относительно близко к границе наихудшего случая и относительно далеко от многоугольника дикого типа. Аналогично, термин "близко вне многоугольника дикого типа" означает относительную близость к многоугольнику дикого типа в сравнении с расстоянием от границы наихудшего случая.

Способ, определенный здесь выше, ограничен в том смысле, что измеряемая устойчивость к ингибитору зависит от выбора концентраций применяемого ингибитора. Необходимо также стараться снизить эффекты биологической вариабельности. Поэтому желательно получить отсчет для максимальной устойчивости - наихудшего случая - там, где ожидается, что данный ингибитор неэффективен. Эта концентрация, например 100 μМ, обычно является максимальной концентрацией, которую практически можно измерить, но ее можно установить также, например, в фармакологических, токсикологических или фармакокинетических исследованиях. Сравнение уровня устойчивости для обследуемого пациента с максимальной измеряемой устойчивостью определяет, каков достоверный уровень устойчивости для данного пациента. Максимальную измеряемую устойчивость и реальную устойчивость можно удобно представить гистограммой, как описано ниже.

В еще одном предпочтительном осуществлении изобретения каждый из указанных трех или более наборов данных содержит величину измеряемой устойчивости наихудшего случая к данному ингибитору, причем указанные значения наихудшего случая представлены на указанных графических изображениях таким образом, что отсчет данных для химерного набора можно сравнить как с ВИЧ дикого типа, так и с ВИЧ наихудшего случая, что дает таким образом оценку относительного значения для данного ингибитора.

В экспериментах с образцами от более чем 150 пациентов была установлена хорошая корреляция между развитием устойчивости и историей терапии, как будет проиллюстрировано ниже в примерах. Хорошая корреляция была найдена у данных, полученных в соответствии с изобретением, с результатами применения классических методов выделения вируса и фенотипирования.

Итак, способ в соответствии с данным изобретением можно использовать для индивидуализированного и более рационального определения оптимальной химиотерапии ВИЧ. Таким образом, использование способа в соответствии с данным изобретением в комбинации с правильным применением анти-ВИЧ лекарств должно в конечном итоге привести к улучшению лечения и повышению выживаемости пациентов, инфицированных ВИЧ.

Способ в соответствии с изобретением имеет особое применение, когда определенный пациент получал много различных лекарств и характер мутаций его вируса лечащим врачам трудно определить.

В соответствии со следующим аспектом изобретения предлагается способ определения оптимальной химиотерапии пациентов, серопозитивных по ВИЧ, включающий в себя следующие этапы: (а) периодическую оценку фенотипической чувствительности штаммов ВИЧ пациента способом, описанным выше; (б) проведение химиотерапии выбранным ингибитором, если штаммы ВИЧ пациента остаются восприимчивыми к выбранной химиотерапии; в) выбор другого ингибитора, в том случае, когда чувствительность к первоначальному ингибитору снижается.

Приспособление для определения клинического курса в соответствии с данным изобретением названо "Антивирограмма", и этот термин будет использоваться далее в описании изобретения. Это приспособление дает врачам ясное представление об относительных изменениях и восприимчивости к различным ингибиторам, которые используются или могут быть использованы в клиническом курсе отдельных пациентов.

Под термином ВИЧ в контексте настоящего изобретения в основном понимается ВИЧ-1. Однако настоящее изобретение применимо также и к ВИЧ-2.

Предпочтительно одновременно определяют фенотипическую чувствительность указанных химерных вирусов к ингибиторам по крайней мере двух ферментов, кодируемых pol геном ВИЧ.

В следующем аспекте изобретения предлагается способ определения фенотипической лекарственной чувствительности индивидуальных штаммов ВИЧ пациента к ингибиторам по крайней мере двух ферментов, кодируемых pol геном ВИЧ, заключающийся в трансфекции линии клеток, восприимчивых к инфекции ВИЧ, нуклеотидной последовательностью из pol гена ВИЧ, кодирующей указанный фермент и полученной выделением вирусной РНК из образца биологического материала пациента и обратной транскрипцией необходимой области указанного pol гена, и сконструированной ДНК ВИЧ, из которой указанная последовательность делетирована, культивации указанных грансфецированных клеток, так чтобы создать набор химерных вирусов и оценку фенотипической чувствительности указанных химерных вирусов к ингибиторам указанных ферментов, кодируемых pol геном ВИЧ.

Необходимую нуклеотидную последовательность pol гена выделяют из образца биологического материала, полученного от пациента, чью фенотипическую лекарственную чувствительность определяют. Для выделения нужной последовательности могут быть использованы разнообразные биологические материалы.

Так, биологический материал может быть отобран из плазмы, сыворотки или бесклеточной жидкости, отобранной из семени или вагинальной жидкости. Плазма в особенности предпочтительна и особенно удобна для использования ОКПК в соответствии с предыдущими приемами, описанными выше.

В качестве альтернативы биологическим материалом может быть цельная кровь, к которой добавлен стабилизатор РНК.

В следующем варианте осуществления биологическим материалом может быть плотный материал ткани, отобранный из ткани мозга или ткани лимфатического узла, или другой ткани, полученной биопсией.

Как продемонстрировано ниже, если для выделения требуемой последовательности используют такой биологический материал, как плазма, достаточен минимальный объем плазмы, обычно около 100-250 мкл, чаще около 200 мкл.

Далее, предпочтительно из ОТ, протеазы и интегразы ВИЧ отбирают два избранных фермента.

Вирусную РНК удобно выделять в соответствии с изобретением методами, известными per se, например методом Boom R. et al. (Journal of Clinical Microbiology. 1990. V. 28. N 3. P. 495-503).

В случае плазмы, сыворотки и бесклеточных жидкостей тела можно также использовать набор для вирусной РНК "QlAamp", производимый группой компаний "Qiagen".

Предпочтительно линией клеток, восприимчивых к инфекции ВИЧ, является линия Т-клеток CD4⁺.

Далее, предпочтительно линией Т-клеток CD4⁺ является линия клеток МТ4 или линия клеток HeLa CD4⁺.

Обратная транскрипция может быть осуществлена с помощью коммерческого набора, как, например, набора обратной транскриптазы GeneAmp, производимого фирмой Perkin Elmer.

Необходимую область pol гена пациента предпочтительно транскрибировать с использованием нисходящего праймера.

В том случае, когда последовательностью, подлежащей обратной транскрипции, является последовательность, кодирующая обратную транскриптазу или обратную транскриптазу и протеазу, нисходящим праймером предпочтительно является OUT3: 5'-CAT TGC TCT, CCA, ATT ACT GTG ATA TTT CTC ATG-3' (SEQ ID NO: 1).

В особенно предпочтительном осуществлении ген ОТ ВИЧ пациента и ген протеазы ВИЧ подвергают обратной транскрипции с использованием специфического для ВИЧ-1 праймера OUT3 и геноинженерной обратной транскриптазы, лишенной активности РНКазы Н, так чтобы транскрибируемую валовую РНК превратить в кДНК без деструкции. Такую геноинженерную, обратную транскриптазу "Expand®" можно получить от фирмы Boehringer Mannheim GmbH.

Обратная транскриптаза "Expand" представляет собой РНК-зависимую ДНК-полимеразу. Этот фермент - геноинженерная версия обратной транскриптазы вируса мышиной лейкемии Молони (M-MuLV-RT). Точечная мутация в последовательности для РНКазы Н снижает активность РНКазы Н до значений ниже уровня чувствительности ее обнаружения. Использование этой геноинженерной обратной транскриптазы позволяет получать транскрипты кДНК полной длины.

После обратной транскрипции транскрибированную ДНК амплифицируют методом ПЦР.

Предпочтительно продукт обратной транскрипции амплифицируют с использованием метода ПЦР с фланкированием последовательностей.

Предпочтительно в случае, когда рассматриваемая область - это область ОТ, используют метод ПЦР с фланкированием последовательностей с применением внутренних и внешних праймеров, как описано Kellam P. and Larger B.A. (1994) (см. выше). Если рассматриваемая область перекрывает гены ОТ и протеазы, то используемые специфические праймеры - предпочтительно комбинация OUT3/IN3 (нисходящий) и RVP5 (восходящий).

Праймер RVP5 (Maschera В. а.о. Journal of Virology. V. 69. P. 5431-5436) имеет последовательность 5'-GGGAAGATCTGGCC TTCCTACAAGGG-3' (SEQ ID NO: 2).

Амплификация схематически представлена графой 4 на фиг. 3 и более подробно описана в примере 2.

Амплификация кДНК протеазы фактически включает методику ПЦР с полуфланкированием, как будет ясно из фиг. 3.

Методика ПЦР с фланкированием имеет преимущество перед известными простыми методиками ПЦР, т.к. позволяет получать наиболее специфический продукт ПЦР.

Однако, чтобы при ПЦР получить еще большие эффективность прочтения и выход, можно использовать смесь термостабильных полимераз (Barnes W.M. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. V. 91. P. 2216-2220). Такую смесь полимераз можно получить от фирмы Boehringer Mannheim GmbH под названием "Высокоэффективная система ПЦР "Expand®". С помощью этой системы удалось повысить эффективность в 10 или более раз в сравнении с эффективностью обычной ПЦР методики с применением одной полимеразы Taq.

Если область pol гена перекрывает гены ОТ и протеазы, предпочтительно, чтобы сконструированная ДНК ВИЧ была такой, из которой делетированы гены ОТ и протеазы, и это была бы плазмида pGEMT3-ΔPRT, депонированная в бельгийской координационной коллекции микроорганизмов 8 ноября 1996 г. под номером LMBP3590.

Тем не менее можно разными способами создать плазмиду, содержащую провирус ВИЧ-1 с делецией генов протеазы и ОТ. Одна из возможностей состоит во введении необходимой делеции мутагенезом под действием олигонуклеотидов. Однако избранная далее в примере 2 методика состоит в создании необходимой конструкции с применением специфических рестриктаз и субклонирования, как описано ниже. Хотя конечный результат зависит от наличия необходимых сайтов рестрикции, главное достоинство этой методики заключается в быстроте получения конечных результатов.

Чтобы обеспечить наиболее эффективную трансфекцию, ПЦР-продукт, подлежащий трансфекции, в идеале следует очистить на ионообменных центрифужных колонках известным per se способом. Группа компаний "Qiagen" выпускает подходящий набор под названием "QlAquick PCR Purification Kit".

Трансфекцию можно осуществить методом электропорации или с использованием липидов, в особенности катионных, ДЭАЭ-декстрана, CaHPO₄ и т.д.

При трансфекции с липидами можно использовать набор "PERFECT®" фирмы "Invitrogen" (Лик, Нидерланды).

Итак, для трансфекции используют сконструированную ДНК ВИЧ, в которой делетированы необходимые ген или гены из системы pol гена, вместе с продуктом амплификации.

ДНК-конструкцией может быть плазмида pHIVΔRT фирмы "Medical Research Council (MRC)", если нужно делетировать только ген ОТ. Если делетированы гены и ОТ, и протеазы, удобно использовать в качестве ДНК-конструкции описанную здесь плазмиду pGEMTЗ-ΔPRT, которая является высокопийным вектором. Такие плазмиды перед трансфекцией линеаризуют известными per se методами.

Особенное преимущество в использовании конструкции, кодирующей более чем один фермент pol гена, например конструкции ΔPRT, состоит в том, что в этом случае можно включить большее количество исходного материала пациента, чем в случае использования одного гена, так что амплифицированный материал более полно отражает генетическое разнообразие штаммов данного обследуемого пациента.

Следует подчеркнуть желательность того, чтобы специфические праймеры для ПЦР с фланкированием располагались снаружи базовых последовательностей целевых ферментов, подлежащих амплификации и анализу. Кроме того, комбинация ОТ и протеазы предпочтительна и дает лучшие результаты в исследовании ОТ, чем система только с ОТ, из-за того, что в этом случае еще 40 аминокислот исходят от пациента. Для изучения протеазы следует удостовериться, что первые 9 аминокислот протеазы происходят из базовой последовательности дикого типа конструкции pGEMT3-ΔPRT.

Если трансфекцию клеток осуществляют электропорацией, для хорошего роста клеток и выхода вируса требуется оптимизация определенных параметров. Удобно проводить электропорацию при приблизительно 250 мкФ и 300 В. Предпочтительно проводить электропорацию в присутствии около 10 мкг линеаризованной плазмиды, например pHIVΔRTBstEII, и около 5 мкг продукта ПЦР, например продукта ОТ ПЦР. В случае эффективной внутриклеточной гомологичной рекомбинации новый химерный ВИЧ образуется в течение 5-10 дней. При использовании обычных методик для образования химерного ВИЧ требуется культивация в течение 12-14 дней. Аликвоты культуральной надосадочной жидкости хранят при температуре -70^oC или ниже.

Очевидно, что можно использовать эти методики для выделения и амплификации других генов ВИЧ, например гена интегразы, или нескольких генов ВИЧ, например генов ОТ и интегразы вместе, и трансфекции Т-клеток CD4⁺ соответствующими продуктами ПЦР интегразы или ОТ/интегразы вместе с подходящей конструкцией ДНК ВИЧ, из которой делетирован нужный ген (или гены).

Новообразованные химерные вирусы титруют и анализируют на фенотипическую чувствительность (или восприимчивость) к различным ингибиторам ферментов ро1 гена, предпочтительно с помощью автоматизированных клеточных тестов.

Предпочтительно выражать фенотипическую лекарственную чувствительность химерных вирусов и штамма ВИЧ дикого типа - соответствующего рекомбинантного штамма ВИЧ дикого типа к одному или более ингибиторам величиной ингибирующей концентрации (значением IC).

Восприимчивость химерных вирусов и штамма ВИЧ дикого типа к одному или более ингибиторам ОТ и/или одному или более ингибиторам протеазы можно выражать, например, величиной концентрации при 50% или 90% ингибировании (IC₅₀ или IC₉₀).

Предпочтительно ингибиторы ОТ выбирают среди нуклеозидных ингибиторов ОТ, как, например, азидотимидин (АЗТ), ddl (диданозин - "Videx®"), ddC (зальцитабин), 3ТС (ламивудин), d4T (ставудин), таких ненуклеозидных ингибиторов ОТ, как делавиридин (U 9051125 (ВМАР) -"Rescriptor®"), ловирид (αАРА), невирапин (B1-RG-587 - "Viramune®") и тивирапин (8-CI-TIBO(R86183)), таких ингибиторов протеазы, как сагинавир, индинавир и ритонавир, и таких ингибиторов интегразы, как фенилэтиловый эфир кофеиновой кислоты (САРЕ).

Подходящие ингибиторы ОТ и/или интегразы выбирают из нуклеозидных ингибиторов ОТ - как, например, АЗТ, ddl, ddC, 3ТС, d4T, 1592U89 и др., таких ненуклеозидных ингибиторов ОТ, как ловирид, невирапин, делавиридин, атевиридин, тивирапин (8-CI-TIBO) и др., таких ингибиторов протеазы, как сагинавир, индинавир, ритонавир и др., и таких ингибиторов интегразы, как фенилэтиловый эфир кофеиновой кислоты (САРЕ), а также ингибиторов интегразы ВИЧ типа описанных в патентной заявке WO 95/08540 и патенте GB 2,271,566.

Способ по настоящему изобретению включает этап сравнения фенотипической лекарственной чувствительности штаммов ВИЧ пациента к одному или более ингибиторам ОТ и/или одному или более ингибиторам протеазы и/или одному или более ингибиторам интегразы с чувствительностью штамма дикого типа. Для более наглядного представления относительных изменений в восприимичивости к различным испытываемым лекарственным соединениям (или их комбинациям) сконструирована диаграмма "Антивирограмма".

Диаграмму следует интерпретировать следующим образом: эксцентрические отсчеты на антивирограмме указывают на химиотерапевтические режимы, дальнейшее применение которых для ВИЧ-инфицированного пациента бесполезно, тогда как значения внутри референсного многоугольника или на нем, или только немного за границей референсного многоугольника указывают химиотерапевтические режимы, перспективные для применения.

Способы по настоящему изобретению в сочетании с применением правильных анти-ВИЧ лекарств должны в конце концов привести к повышению эффективности лечения, улучшению состояния и снижению смертности ВИЧ-инфицированных пациентов вследствие того, что таким образом можно предотвратить или прервать лечение, неэффективное из-за присутствия или возникновения устойчивых штаммов ВИЧ, и в нужный момент можно применить эффективную химиотерапию.

Перечень фигур графических материалов Фиг. 1 - схема конструирования плазмиды pGEMT3-ΔPRT;
Фиг. 2 - более подробная дополнительная схема конструирования плазмиды pGEMT3-ΔPRT;
Фиг. 3 - схема области нуклеотидных последовательностей ВИЧ-НХВ2D, содержащей гены протеазы и ОТ;
Фиг. 4 А-Н - полная нуклеотидная последовательность области нуклеотидных последовательностей ВИЧ-НХВ2D, содержащей гены протеазы и ОТ;
Фиг. 5 - антивирограмма для пациента, у которого обнаружены устойчивые к 3ТС штаммы ВИЧ, как описано в примере 5;
Фиг. 6 - антивирограмма для не получавшего лечения пациента, у которого обнаружены штаммы ВИЧ, подобные дикому типу, как описано в примере 6;
Фиг. 7А - гистограмма, показывающая относительное изменение лекарственной восприимчивости у пациента из примера 7;
Фиг. 7Б - антивирограмма для пациента из примера 7;
Фиг. 8А - гистограмма, показывающая относительное изменение лекарственной восприимчивости у пациента из примера 8;
Фиг. 8Б - антивирограмма для пациента из примера 8;
Фиг. 9А - гистограмма, показывающая относительное изменение лекарственной восприимчивости у пациента из примера 9;
Фиг. 9Б - антивирограмма для пациента из примера 9;
Фиг. 10А - гистограмма, показывающая относительное изменение лекарственной восприимчивости у пациента из примера 10;
Фиг. 10Б - антивирограмма для пациента из примера 10;
Фиг. 11А - гистограмма, показывающая относительное изменение лекарственной восприимчивости у пациента из примера 11;
Фиг. 11Б- антивирограмма для пациента из примера 11;
Фиг. 12А - гистограмма, показывающая относительное изменение лекарственной восприимчивости у пациента из примера 12;
Фиг. 12Б - антивирограмма для пациента из примера 12;
Далее изобретение будет иллюстрировано примерами.

Примеры осуществления изобретения
Пример 1
Протокол
1. Выделение и амплификация вирусной РНК.

РНК выделяли из 100 мкл плазмы по методу, описанному Boom R. а.о. (1990) (см. выше) и транскрибировали с помощью набора обратной транскриптазы GeneAmp фирмы Perkin Elmer в соответствии с указаниями производителя и с использованием специфического для ВИЧ-1 нисходящего праймера (OUT3: 5'-CAT TGC TCT CCA ATT ACT GTG ATA ТТТ CTC ATC-3'; SEQ ID NO: 1). На обратно транскрибированной РНК проводили ПЦР с внутренним и внешним праймерами, как описано Kellam P. and Larger B.A. (1994) (см. выше). После экстракции хлороформом и центрифугирования через колонки Centricon 100 или через анионообменные центрифужные колонки (Quiagen) выделенный продукт ПЦР был готов к использованию в реакциях трансфекции.

2. Конструирование и выделение плазмиды.

Продукцию плазмиды pHIVΔRT (MCR) осуществляли в Е. coli. Плазмидную ДНК выделяли из суточных культур с использованием колонок Qiagen в соответствии с рекомендациями производителя. Выход выделенной плазмиды определяли спектрофотометрически на основании измерений А260/280 (измерений оптической плотности при λ = 260 и 280 нм). Из 500 мл бактериальной культуры получали около 250 мкг сверхчистой плазмидной ДНК. Идентичность выделенной плазмиды подтверждали рестрикционным анализом. Затем выделенную плазмидную ДНК линеаризовали рестриктазой BstEII и снова очищали классической экстракцией смесью фенол/хлороформ.

3. Трансфекция клеток.

Клетки МТ4 субкультивировали для трансфекции до концентрации 250000 клеток/мл (экспоненциальная фаза роста). Клетки осаждали центрифугированием и ресуспендировали в буферном фосфатно-солевом растворе (PBS) при концентрации 3,1•10⁶ клеток/мл. Для каждой трансфекции использовали порцию 0,8 мл (2,5•10⁶ клеток/мл). Трансфекцию осуществляли с помощью импульсного источника напряжения фирмы "Bio-Rad Gene" в 0,4 см электродных кюветах. Электропорацию клеток проводили в присутствии 10 мкг линеаризованной плазмиды pHIVΔRT и около 5 мкг продукта ПЦР ОТ при 250 мкФ и 300 В, после чего инкубировали 30 мин при комнатной температуре. Затем к клеточной суспензии добавляли 10 мл свежей культуры и проводили инкубацию при 37^oC во влажной атмосфере 5% CO₂.

4. Культивирование и использование трансфецированных клеток.

В течение 7-10 дней после трансфекции клетки проверяли на наличие цитопатогенного эффекта. При его отсутствии клетки субкультивировали в отдельных флаконах. Затем культуральную надосадочную жидкость трансфецированных клеток использовали для создания набора рекомбинантных вирусов и хранили в аликвотах по 1,5 мл при -70^oC.

5. Анализ рекомбинантного вируса, полученного из вирусной РНК пациента.

После титрования новых вирусов их наборы использовали для антивирусных опытов в присутствии последовательных разведений различных ингибиторов ВИЧ. Титры в отобранных надосадочных жидкостях определяли предельным титрованием вируса в последовательных разведениях в клетках МТ4.

В антивирусных опытах использовали вирусы с подходящим титром. С этой целью планшеты для титрования с 96 ячейками заполняли 100 мкл полной культуральной среды. Затем в серии ячеек с дублированием добавляли рабочие растворы соединений в объеме 25 мкл. Для каждого лекарства или комбинации лекарств вводили образцы клеток, инфицированных ВИЧ и плацебо. В микротировальные планшеты добавляли экспоненциально растущие клетки Т4 при концентрации 150000 клеток/мл. Затем культуры клеток инкубировали при 37^oC во влажной атмосфере 5% CO₂. Через 5 дней после заражения спектрофотометрически определяли выживаемость клеток, инфицированных ВИЧ и плацебо по методу МТТ (Pauwels R. а.о. J. Virol. Meth. 1988. V. 20. P. 309-321), как описано ниже в разделе 6.

6. Анализ методом МТТ.

В каждую ячейку планшетов для микротитрования добавляли 20 мкл раствора красителя МТТ (7,5 мг/мл в буферном фосфатно-солевом растворе). Затем планшеты инкубировали при 37^oC в течение 1 ч. После этого удаляли 150 мкл среды, не нарушая скоплений клеток МТ4, содержащих кристаллы формазана. Кристаллы формазана растворяли добавлением 100 мкл 5%-ного раствора тритона Х-100 в подкисленном изопропаноле (5 мл концентрированной HCl на 1 л раствора). Кристаллы формазана полностью растворялись после встряхивания планшетов в течение 10 мин в аппарате для встряхивания. После этого измеряли оптическую плотность при двух длинах волн - 540 и 690 нм. По этим величинам оптической плотности (ОП) определяли концентрации 50%-го ингибирования (IC₅₀) и 50%-ного цитотоксического действия (CC₅₀).

Пример 2
Конструкция варианта pHIVΔRTBstEII с делецией гена протеазы и обратной транскриптазы ВИЧ-1.

Повторяли протокол, описанный в примере 1, за исключением того, что рассматриваемой областью pol гена ВИЧ была область, кодирующая ОТ и протеазу, и что создаваемая конструкция - pGEMT3-ΔPRT, как описано далее. Другие модификации методики, изложенной в примере 1, изложены ниже.

Для амплификации вирусной РНК обратную транскрипцию РНК в ДНК вновь проводили с праймером OUT3. Однако для методики ПЦП с фланкированием использовали праймеры, указанные на фиг. 3. Так, далее будет видно, что для этой методики использовали в качестве внешних праймеров VP5 и OUT3, а в качестве внутренних - RVP5 и IN3. Таким образом, эта методика с фланкированием по эффекту является методикой с полуфланкированием.

Продукция и выделение pGEMT3-ΔPRT.

Конечная конструкция pGEMT3-ΔPRT - это производное pGEM9-Zf(-) (Promega).

Вкратце, конструкция pGEMT3-ΔPRT создана введением требуемой вставки ВИЧ-НХВ2 (клон провируса ВИЧ-1 с делецией протеазы и обратной транскриптазы и с фланкирующими нуклеотидными последовательностями человека) в сайт рестрикции Xbal вектора pGEM9-Zf(-). Провирусный геном делетировали от сайта Ahdl в гене протеазы (окружающего 9-ю аминокислоту) до сайта BstEII конструкции pHIVΔRTBstEII (репозиторный индекс MRC: ADB231). По концам делеции ΔProRT располагаются сайты Smal и BstEII, которые можно использовать для линеаризации провирусной конструкции перед трансфекцией. Конструкция pGEMT3-ΔPRT схематически представлена на фиг. 1 и 2. Выход pGEMT3- ΔPRT из 500 мл бактериальной культуры оставлял около 1 мг.

Как указано выше, плазмида pGEMT3-ΔPRT была депонирована 8 ноября 1996 г. под номером LMBP3590 в Бельгийских координационных коллекциях микроорганизмов (ВССМ LMBP-Collection).

Не предполагалось заранее, что введение провирусного генома в другой вектор (pGEM9-Zf(-) вместо рIВ120) создаст серьезные проблемы. рIВ120 (производное pEMBL8(-), согласно информации Kodak Scientific Imaging Systems) и pGEM9-Zf(-) - похожие векторы. Тем не менее провирусный вектор pIB120HIV может оказаться нестабильным в клетках Е. coli rесА⁺. Поэтому после каждого нового приготовления плазмиды следует проверять стабильность конструкции pGEMT3-ΔPRT.

Последовательность ВИЧ-НХВ2
Рассматриваемая область в пределах последовательности ВИЧ-НХВ2D (от нуклеоитида 1800 до нуклеотида 4400) представлена на фиг. 3 (схема) и фиг. 4 (полная последовательность). Указано также расположение нескольких генов, сайтов рестрикции, праймеров и делеций (ΔPro, ΔRT, ΔProRT).

Последовательность ВИЧ-1 (изолят НХВ2, референсный геном, 9718 пар оснований) была получена из Национального центра биотехнологической информации (NCBI), Национальной медицинской библиотеки, Национальных институтов здоровья с помощью системы поиска документов "ENTREZ".

Название в банке генов: HIVHXB2CG
N по каталогу банка генов: 03455
Шифр последовательности NCBI: NCBI Seq.lD N: 327742
Области рекомбинации
В комбинации с фрагментами ОТ-ПЦР, полученными с праймерами RVP5 и OUT3/IN3, вектор pGEMT3-ΔPRT может быть использован для трансфекции клеток МТ4, как описано в примере 1, раздел 3. Область для рекомбинации на 5'-конце ΔProRT содержит 188 нуклеотидов. Область рекомбинации на 3'-конце ΔProRT подобна описанной ранее (Kellam P. and Larder B.A. (1994), см. выше) и содержит 130 нуклеотидов.

Длина этих областей для рекомбинации существенна. Имеющиеся данные (Bandyopadhyay Р. К. et. al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. V. 81. P. 3476-3480; Rubnitz J. and Subramani S. (1984), см. выше) показывают, что, если область нуклеотидной гомологии уменьшить с 214 до 163 пар оснований, может произойти 10-кратное снижение вероятности рекомбинации. Более того, для уверенности в том, что созданный вирусный фенотип реально соответствует квазивидам, имеющимся у пролеченного ВИЧ-серопозитивного пациента, в клетках, подвергнутых электропорации, должно произойти достаточное количество актов рекомбинации. Оптимизация событий рекомбинации может быть достигнута прежде всего выбором соотношения между линеаризованным вирусным провектором и фрагментом ОТ-ПЦР, использованным для электропорации клеток-мишеней. Такой стандартный метод с получаемыми типичными результатами был ранее описан (Kellam P. and Larder B.A. (1994) - см. выше). Поэтому было решено увеличить начальное количество вводимого продукта ПЦР с приблизительно 2 мкг (с 10 мкг вектора) до приблизительно 5 мкг или более. Результат этого сказался в быстром появлении видимого роста вируса (цитопатогенный эффект) в культуре трансфецированных клеток.

Другим путем оптимизации рекомбинационных событий могло бы быть конструирование праймеров, приводящее к более длинным последовательностям нуклеотидов для рекомбинации.

Тем не менее реальная загрузка в реакции трансфекции всегда зависит от выхода после ПЦР. Некоторые образцы дают высокий выход и как следствие это ведет к более высокой загрузке амплифицированного материала в реакцию трансфекции (с повышением эффективности рекомбинации). Однако несмотря на низкую эффективность рекомбинации образцы с низким выходом также можно трансфецировать и они могут дать жизнеспособный вирус с достоверным отражением вирусной популяции.

Пример 3
Альтернативные праймеры для ОТ-ПЦР нуклеотидной последовательности ProRT
Были сконструированы новые праймеры (А-Г), родственные использованным в примере 2, которые могут дать более длинные последовательности для рекомбинации как на 5', так и на 3'-конце области ProRT. Для обеспечения ПЦР с фланкированием были сконструированы два праймера как на 5', так и на 3' конце соответственной области. Как указано на фиг. 3 и 4, при конструировании соответствующих праймеров было принято во внимание наличие на 5'-конце области ProRT прямого повтора. Ниже приведены новые праймеры:
A PRTO-5: 5'-GCCCCTAGGA-AAAAGGGCTG-TTGG (SEQ ID No: 3)
Б PRTI-5: 5'-TGAAAGATTG-TACTGAGAGA-CAGG (SEQ ID N: 4)
В PRTI-3: 5'-GATAТТТCTC-ATGTTCATCT-TGGG (SEQ ID N: 5)
Г PRTO-3: 5'-AGGTGGCAGG-TTAAAATCAC-TAGC (SEQ ID N: 6)
Пример 4
Конструирование альтернативного вектора ΔProRT
Как указано выше, конструирование альтернативного вектора с делецией ProRT можно осуществить путем мутагенеза, вызванного олигонуклеотидами. Однако можно также расширить делецию ProRT от имеющегося 3'-конца до следующего сайта Kpnl в гене ОТ (еще 40 пар оснований в направлении вниз). Сшивка лигазой обработанного фрагментом Кленова полимеразы сайта Kpnl с обработанным фрагментом Кленова полимеразы сайтом BstEII восстановит исходную область узнавания сайта BstEII. В таком виде альтернативный вектор ведет себя подобно вектору pGMT3ΔPRT, описанному в примере 2, но имеет несколько большую делецию ОТ.

Пример 5
У инфицированного ВИЧ пациента, получавшего АЗТ с декабря 1989 г. вплоть до недокументированного более позднего срока и переведенного на комбинированную химиотерапию АЗТ+3ТС (1:1) с февраля 1994 г. по октябрь 1995 г., была взята плазма, в которой определяли восприимчивость к набору ингибиторов ОТ в соответствии с описанным выше в примере 1 протоколом. В указанном протоколе в качестве референсного ВИЧ был использован штамм рекомбинантного ВИЧ дикого типа recIIIB. В табл. 1 указаны измеренные величины IC₅₀ (мкМ) и отношения этих величин. Антивирограмма приведена на фиг. 5.

Эти данные показывают, что монотерапия АЗТ бесполезна для данного пациента. Однако комбинированная терапия АЗТ+3ТС еще может дать положительный эффект.

Пример 6
От ВИЧ-инфицированного пациента, не получавшего лекарств, получали плазму, в которой определяли восприимчивость к набору ингибиторов ОТ в соответствии с приведенным выше протоколом примера 1. В указанном протоколе в качестве референсного ВИЧ был использован рекомбинантный штамм ВИЧ дикого типа recIIIB. В табл. 2 приведены измеренные значения IC₅₀ (мкМ) и соотношения указанных значений. Была составлена антивирограмма, представленная на фиг. 6.

По этим данным можно определить, что пациент инфицирован штаммами ВИЧ, весьма похожими на ВИЧ дикого типа. Ни один из лекарственных режимов не следует исключать, поэтому можно начинать химиотерапию с таким лекарством, как АЗТ, имеющим позитивный графический отсчет.

Пример 7
У ВИЧ-инфицированного пациента, не получавшего лекарств, отбирали плазму, в которой определяли восприимчивость к набору ингибиторов ОТ согласно приведенному в примере 1 протоколу. В качестве референсного ВИЧ использовали рекомбинантный штамм ВИЧ дикого типа recIIIB. В табл. 3 приведены измеренные значения IC₅₀ (мкМ) и соотношения указанных значений. Гистограмма, показывающая относительное изменение восприимчивости к лекарствам, приведена на фиг. 7А. Была составлена также энтивирограмма, представленная на фиг. 7Б.

По этим данным можно определить, что пациент инфицирован штаммом ВИЧ, весьма близким к ВИЧ дикого типа. Ни один из лекарственных режимов не следует исключать, поэтому можно начинать химиотерапию с таким лекарством, как АЗТ, 3ТС или др., имеющим позитивный графический отсчет.

Пример 8
У ВИЧ-инфицированного пациента, получавшего терапию, включавшую АЗТ, 3ТС и ловирид, получали плазму, в которой определяли восприимчивость к набору ингибиторов ОТ в соответствии с приведенным в примере 1 протоколом. В качестве референсного ВИЧ был использован рекомбинантный штамм ВИЧ дикого типа recIIIB. В табл. 4 приведены измеренные значения IC₅₀ (мкМ) и соотношения указанных значений. Гистограмма, показывающая относительное изменение восприимчивости к лекарствам, приведена на фиг. 8А. Была составлена также антивирограмма, представленная на фиг. 8Б.

По этим данным можно определить, что пациент инфицирован штаммом ВИЧ, проявляющим пониженную восприимчивость к большинству испытанных нуклеозидных и ненуклеозидных антиретровирусных лекарств. Можно все же начинать химиотерапию с D4T или DDC. Можно рассмотреть включение в терапию ингибиторов протеазы.

Пример 9
У ВИЧ-инфицированного пациента, получавшего терапию, включавшую множественное применение ингибиторов ОТ типа нуклеозидных аналогов, получали плазму, в которой определяли восприимчивость к набору ингибиторов ОТ в соответствии с приведенным в примере 1 протоколом. В качестве референсного ВИЧ был использован рекомбинантный штамм ВИЧ дикого типа recIIIB. В табл. 5 приведены измеренные значения IC₅₀ (мкМ) и соотношения указанных значений. Гистограмма, показывающая относительное изменение восприимчивости к лекарствам, приведена на фиг. 9А. Была составлена также антивирограмма, представленная на фиг. 9Б.

По этим данным можно определить, что пациент инфицирован штаммом ВИЧ, проявляющим пониженную восприимчивость ко всем антиретровирусным лекарствам типа нуклеозидных аналогов. Ненуклеозидные антиретровирусные лекарства не следует исключать из терапии. Здесь также следует учесть возможность включения в терапию ингибиторов протеазы.

Пример 10
У ВИЧ-инфицированного пациента, не получавшего лекарств, отбирали плазму, в которой определяли восприимчивость к набору ингибиторов ОТ и протеазы согласно приведенному в примере 1 протоколу. В качестве референсного ВИЧ использовали рекомбинантный штамм ВИЧ дикого типа recIIIB. В табл. 6 приведены измеренные значения 1050 (мкМ) и соотношения указанных значений. Гистограмма, показывающая относительное изменение восприимчивости к лекарствам, приведена на фиг. 10А. Была составлена также антивирограмма, представленная на фиг. 10Б.

По этим данным можно определить, что пациент инфицирован штаммом ВИЧ, весьма близким к ВИЧ дикого типа. Ни один из лекарственных режимов не следует исключать, поэтому можно начинать химиотерапию с таким лекарством, как АЗТ, 3ТС или др., имеющим позитивный графический отсчет.

Пример 11
У ВИЧ-инфицированного пациента, получавшего терапию, включавшую применение ингибиторов ОТ и протеазы, получали плазму, в которой определяли восприимчивость к набору ингибиторов ОТ и ингибиторов протеазы в соответствии с приведенным в примере 1 протоколом. В качестве референсного ВИЧ был использован рекомбинантный штамм ВИЧ дикого типа recIIIB. В табл. 7 приведены измеренные значения IC₅₀ (мкМ) и соотношения указанных значений. Гистограмма, показывающая относительное изменение восприимчивости к лекарствам, приведена на фиг. 11А. Была составлена также антивирограмма, представленная на фиг. 11 Б.

По этим данным можно установить, что пациент инфицирован штаммом ВИЧ, проявляющим пониженную восприимчивость к ингибитору ОТ - 3ТС и ингибиторам протеазы индинавиру и ритонавиру. Соответственно, можно назначить химиотерапию с такими лекарствами, как АЗТ или сагинавир, дающими позитивный графический отсчет.

Пример 12
У ВИЧ-инфицированного пациента, получавшего терапию, включавшую применение ингибиторов ОТ и протеазы, получали плазму, в которой определяли восприимчивость к набору ингибиторов ОТ и ингибиторов протеазы в соответствии с приведенным в примере 1 протоколом. В табл. 8 приведены измеренные значения IC₅₀ (мкМ) и соотношения указанных значений. Гистограмма, показывающая относительное изменение восприимчивости к лекарствам, приведена на фиг. 12А. Была составлена также антивирограмма, представленная на фиг. 12Б.

По этим данным можно определить, что пациент инфицирован штаммом ВИЧ, проявляющим пониженную восприимчивость к ингибиторам ОТ: 3ТС и АЗТ и к ингибиторам протеазы: индинавиру, ритонавиру и сагинавиру.

Пример 13
Сравнение фенотипирования с генотипированием
У ВИЧ-инфицированных пациентов, получавших длительную монотерапию ненуклеозидным ингибитором ОТ (NNRTI), отбирали образцы плазмы. Выделяли РНК ВИЧ, подвергали ее обратной транскрипции и амплифицировали, как описано в примере 1. Амплифицировали первые 785 нуклеозидов гена ОТ, используя продукт ПЦР из серопозитивных образцов, и этот материал использовали затем для генотипирования.

Вкратце, фрагмент длиной 785 нуклеотидов подвергали реакциям циклического секвенирования с использованием набора "ThermoSequenase®" фирмы "Amersham" (кат. N RPN2438) для циклического секвенирования в присутствии флуоресцентно меченных праймеров с 7-деаза-dGTP. Для каждого образца были использованы 4 секвенирующих праймера, чтобы получить секвенирование в обоих направлениях от нуклеотида 27 до нуклеотида 681 гена ОТ. Продукты реакций анализировали в автоматическом секвенаторе, ALF_® y фирмы "Pharmacia". Полученные последовательности вводили в компьютер "Macintosh" и затем анализировали с применением программы "GeneWorks 2.5" (Oxford Molecular Group Inc. ). Полученные последовательности аминокислот сравнивали с соответствующей последовательностью лабораторного клона ВИЧ-1 HXB2D и идентифицировали в материале пациентов мутации, связанные с устойчивостью. Результаты приведены в табл. 9, где использованы однобуквенные обозначения аминокислот.

В верхней строке табл. 9 указаны найденные в последовательности дикого типа аминокислоты (АК) и их положения. Изменения аминокислот в этих положениях для каждого пациента указаны в нижеследующих строках. Указаны только те положения, в которых в материале пациентов обнаружены изменения. Правая часть табл. 9 дает сводную устойчивость к различным ингибиторам ОТ, определенную в каждом из образцов пациентов способом по предлагаемому изобретению. NNRTI 1 - ненуклеозидный ингибитор ОТ, применявшийся у пациентов. NNRTI 2 - другой ненуклеозидный ингибитор ОТ, для которого до некоторой степени наблюдалась перекрестная с 1-м ингибитором устойчивость.

Получены следующие генотипические результаты по устойчивости к ингибиторам типа аналогов нуклеозидов:
M41L, D67N, K70R, T215F/Y и K219Q/E - это мутации, связанные с устойчивостью к AЗT (Larder В. and Kemp S. Science. 1989. V. 246. P. 1155-1158; Kellam P. a.o. PNAS. 1992. V. 89. P. 1934-1938). Их наличие, по отдельности или в различных комбинациях, в геноме ВИЧ, выделенных из материала пациентов, коррелирует с фенотипической устойчивостью, определенной по разработанным антивирограммам (пациенты 11 и 12).

Это же относится и к устойчивости к 3ТС, связанной с мутацией M184V (Tisdale М. а.о. PNAS. 1993. V. 90. P. 5653-5656), которая наблюдается только у пациентов, обнаруживающих фенотипическую устойчивость к лекарству (пациенты 11 и 16).

Генотипические результаты, касающиеся устойчивости к ингибиторам NNRTI:
Три пациента (3, 4 и 12) не имеют мутации, связанной с устойчивостью к NNRTI, и фенотипически чувствительны к лекарству.

Большинство пациентов, обнаруживающих фенотипическую устойчивость к ингибиторам NNRTI, имеют связанную с устойчивостью к NNRTI мутацию в положении 103 (K102N/S).

Один из пациентов (9) имеет связанную с устойчивостью к NNRTI мутацию Y181C и обнаруживает высокую фенотипическую устойчивость (более чем в 1432 раза) к NNRTI 1.

Пациент 13 имеет несколько мутаций, связанных с устойчивостью к NNRTI (К101Е, частично K103N и частично G190A). Этот пациент также проявляет высокую фенотипическую устойчивость (более чем в 1466 раз) к NNRTI 1. Обнаруженная в этом образце мутация Е138А не связана до такой степени с устойчивостью. Однако было показано, что другая мутация в этом положении, Е138К, играет важную роль в устойчивости к соединениям TSAO (Balzarini J. а.о. PNAS. 1993. V. 90. P. 6952-6956). Роль мутации Е138А еще предстоит установить.

Пациент 20 имеет связанную с устойчивостью к NNRTI мутацию A98G и проявляет фенотипическую устойчивость к испытанным NNRTI.

Пациент 22 имеет связанную с устойчивостью к NNRTI мутацию V1081, но не обнаруживает никакой фенотипической устойчивости к испытанным NNRTI.

Пациент 24 не имеет связанной с устойчивостью к NNRTI мутации (мутация K101Q найдена в геномах некоторых ВИЧ дикого типа), но фентипически устойчив к испытанным NNRTI.

Перечень нуклеотидных последовательностей
(1) Общая информация:
(i) Заявитель
(А) Имя: VIRCO N.V.

(В) Улица: Drie Eikenstraat 661
(С) Город: Edegem
(Е) Страна: Belgium
(F) Почтовый индекс (ZIP): В-2650
(А) Имя: DE BETHUNE, Marie-Pierre
(В) Улица: Tweeleeuwenstraat 15
(С) Город: Everburg
(Е) Страна: Belgium
(F) Почтовый индекс (ZIP): В-3078
(А) Имя: HERTOGS, Kurt
(В) Улица: Sint Vincentiusstraat 53
(С) Город: Antwerpen
(Е) Страна: Belgium
(F) Почтовый индекс (ZIP): В-2018
(А) Имя: PAUWELS, Rudi
(В) Улица: Damstraat 166
(С) Город: Weerde
(Е) Страна: Belgium
(F) Почтовый индекс (ZIP): В-1982
(ii) Название изобретения: Способ определения оптимальной химиотерапии пациентов, серопозитивных по ВИЧ, основанный на фенотипической лекарственной чувствительности человеческих штаммов ВИЧ
(iii) Количество последовательностей: 6
(iv) Компьютерная форма:
(А) Носитель: Гибкий диск
(В) Компьютер: IBM PC - совместимый
(С) Операционная система: PC-DOS/MS-DOS
(D) Программа: Patentin Release #1.0, Version #1.30
(EPO)
(vi) Данные приоритетной заявки:
(А) Номер заявки: ЕР 96200175.6
(В) Дата подачи: 26-JAN-1996
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO 1:
(i) Характеристика:
(А) Длина: 33 п.н.

(В) Тип: нуклеиновая кислота
(С) Кол-во нитей: однонитевая
(D) Топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: cDNA
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) Естественный источник:
(А) Организм: Вирус иммунодефицита человека, тип 1
(XI) Описание последовательности: SEQ ID NO 1:
CATTGCTCTC CAATTACTGT GATAТТТCTC ATG 33
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO 2:
(i) Характеристика:
(А) Длина: 26 п.н.

(В) Тип: нуклеиновая кислота
(С) Кол-во нитей: однонитевая
(D) Топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: cDNA
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) Естественный источник:
(А) Организм: Вирус иммунодефицита человека, тип 1
(xi) Описание последовательности: SEQ ID NO 2:
GGGAAGATCT GGCCTTCCTA CAAGGG 26
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO 3:
(i) Характеристика:
(A) LENGTH: 24 base pairs
(В) Тип: нуклеиновая кислота
(С) Кол-во нитей: однонитевая
(D) Топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: cDNA
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) Естественный источник:
(А) Организм: Вирус иммунодефицита человека, тип 1
(xi) Описание последовательности SEQ ID NO 3:
GCCCCTAGGA AAAAGGGCTG TTGG 24
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO 4:
(i) Характеристика:
(A) LENGTH: 24 base pairs
(В) Тип: нуклеиновая кислота
(С) Кол-во нитей: однонитевая
(D) Топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: cDNA
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) Естественный источник:
(А) Организм: Вирус иммунодефицита человека, тип 1
(xi) Описание последовательности SEQ ID NO 4:
TGAAAGATTG TACTGAGAGA CAGG 24
(2) Информация о последовательности SEQ ID NO 5:
(i) Характеристика:
(A) LENGTH: 24 base pairs
(В) Тип: нуклеиновая кислота
(С) Кол-во нитей: однонитевая
(D) Топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: cDNA
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) Естественный источник:
(А) Организм: Вирус иммунодефицита человека, тип 1
(xi) Описание последовательности SEQ ID NO 5:
GATAТТТCTC ATGTTCATCT TGGG 24 (2)
Информация о последовательности SEQ ID NO 6:
(i) Характеристика:
(A) LENGTH: 24 base pairs
(В) Тип: нуклеиновая кислота
(С) Кол-во нитей: однонитевая
(D) Топология: линейная
(ii) Молекулярный тип: cDNA
(iii) HYPOTHETICAL: NO
(vi) Естественный источник:
(А) Организм: Вирус иммунодефицита человека, тип 1
(xi) Описание последовательности SEQ ID NO 6:
AGGTGGCAGG TTAAAATCAC TAGC 24

Формула изобретения

1. Способ определения оптимальной химиотерапии ВИЧ пациентов, серопозитивных по ВИЧ, состоящий в трансфекции линии клеток, восприимчивых к инфекции ВИЧ, нуклеотидной последовательностью из pol гена ВИЧ, кодирующей желательный целевой фермент и полученной выделением вирусной РНК из образца биологического материала пациента и обратной транскрипцией необходимой области указанного pol гена, и сконструированной ДНК ВИЧ, из которой указанная последовательность делетирована, культивировании трансфецированных клеток так, чтобы создать набор химерных вирусов, оценке фенотипической чувствительности химерных вирусов к ингибитору фермента, кодируемого pol геном ВИЧ, и определении ее значения, конструировании набора данных, включающих величину чувствительности химерных вирусов и таковую для химерного штамма ВИЧ дикого типа, повторении определения чувствительности, по крайней мере, еще для двух ингибиторов и конструировании, по меньшей мере, трех таких наборов данных, представлении полученных данных в двумерной или трехмерной графической форме так, чтобы разница между величинами чувствительностей химерного вируса и вируса дикого типа в каждом случае давала наглядную картину устойчивости к воздействию данного ингибитора для химерного вируса, и отборе оптимального ингибитора или ингибиторов на основании графического представления измеренных таким образом величин.

2. Способ определения оптимальной химиотерапии по п.1, отличающийся тем, что указанные наборы данных представлены на многоугольной или квазициркулярной диаграмме, содержащей: (а) несколько нормализованных осей, выходящих радиально из начала координат, причем каждая ось соответствует одному набору данных или ингибитору или их комбинации; (б) оси, нормализованные таким образом, что величины чувствительности для ВИЧ дикого типа к различным ингибиторам равны на каждой оси, причем отсчеты данных для ВИЧ дикого типа представлены произвольно и соединены с образованием правильного многоугольника, вершины которого лежат на осях, а центр которого задан началом координат; (в) на каждой оси отложен отсчет, представляющий величину чувствительности набора химерных ВИЧ к ингибитору, соответствующему данной оси, причем отсчеты данных для химерных ВИЧ соединены произвольным образом с образованием правильного или неправильного многоугольника, форма которого представляет устойчивость химерных вирусов к ряду ингибиторов.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что каждая ось имеет логарифмическую шкалу.

4. Способ по п.2 или 3, отличающийся тем, что эксцентрические отсчеты данных, если они имеют место, указывают на ингибиторы, применение которых предположительно будет мало полезным или бесполезным для пациента, тогда как отсчеты данных, лежащие внутри или очень близко вне многоугольника для вируса дикого типа, указывают на ингибиторы, применение которых будет существенно полезным для пациента.

5. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что указанные три или более набора данных содержат дополнительно наихудший вариант значения измеряемой устойчивости к рассматриваемому ингибитору, причем указанные величины для наихудшего варианта представлены в указанных графических диаграммах таким образом, что отсчет данных для набора химерных вирусов может быть сопоставлен как с ВИЧ дикого типа, так и с ВИЧ наихудшего варианта, что обеспечивает таким образом определение относительного значения для ингибитора в данном конкретном случае.

6. Способ определения оптимальной химиотерапии пациентов, серопозитивных по ВИЧ, содержащий этапы: (а) периодического определения фенотипической чувствительности штаммов ВИЧ пациента к ингибитору фермента, кодируемого pol геном ВИЧ; (б) определения оптимальной химиотерапии выбранным ингибитором, если штаммы ВИЧ пациента остаются восприимчивыми к выбранной химиотерапии; (в) выбора другого ингибитора, если и в том случае, когда восприимчивость к исходному ингибитору снижается.

7. Способ по любому из пп.1 - 6, отличающийся тем, что одновременно определяется фенотипическая чувствительность указанных химерных вирусов к ингибиторам по меньшей мере двух ферментов, кодируемых pol геном ВИЧ.

8. Способ определения фенотипической лекарственной чувствительности индивидуальных штаммов ВИЧ у пациента к ингибиторам, по меньшей мере, двух ферментов, кодируемых pol геном ВИЧ, включающий трансфекцию линии клеток, восприимчивых к инфекции ВИЧ, нуклеотидной последовательностью из pol гена ВИЧ, кодирующей указанный фермент и полученной выделением вирусной РНК из образца биологического материала пациента и обратным транскрибированием нужной области указанного pol гена, и сконструированной ДНК ВИЧ, из которой указанная последовательность была делетирована, культивирование указанных трансфецированных клеток, чтобы создать набор химерных вирусов, и измерение фенотипической чувствительности указанных химерных вирусов к ингибиторам указанных ферментов, кодируемых pol геном ВИЧ.

9. Способ по любому из предшествующих пунктов, отличающийся тем, что биологический материал отбирают из плазмы, сыворотки или бесклеточной жидкости тела: семенной или вагинальной.

10. Способ по любому из пп.1 - 8, отличающийся тем, что биологический материал представляет собой цельную кровь, к которой добавлен стабилизатор РНК.

11. Способ по любому из пп.1 - 10, отличающийся тем, что биологический материал представляет собой мозговую ткань или ткань лимфатического узла.

12. Способ по любому из пп.8 - 11, отличающийся тем, что указанные, по меньшей мере, два фермента, кодируемых pol геном ВИЧ, выбирают из обратной транскриптазы, протеазы и интегразы ВИЧ.

12. Способ по любому из пп.1 - 6 и 7 - 12, отличающийся тем, что линия клеток, восприимчивых к инфекции ВИЧ, представляет собой линию T-клеток CD4⁺.

14. Способ по п.13, отличающийся тем, что линия T-клеток CD4⁺ представляет собой линию клеток MT4 или линию клеток HeLa CD4⁺.

15. Способ по любому из пп.1 - 6 и 7 - 14, отличающийся тем, что необходимую область pol гена пациента подвергают обратной транскрипции с использованием специфического нисходящего праймера.

16. Способ по п.15, отличающийся тем, что нуклеотидная последовательность, предназначенная для обратной транскрипции, - это область, кодирующая обратную транскриптазу и протеазу.

17. Способ по п.16, отличающийся тем, что нисходящий промотор представляет собой OUT3: 5'-CAT TGC TCT CCA ATT ACT GTG ATA TTT CTC ATG-3' (SEQ ID NO: 1).

18. Способ по любому из пп.15 - 17, отличающийся тем, что продукт обратной транскрипции амплифицируют с использованием методики ПЦР с фланкированием.

19. Способ по любому из пп.1 - 6 и 7 - 18, отличающийся тем, что сконструированная ДНК ВИЧ представляет собой ДНК, из которой делетированы гены обратной транскриптазы и протеазы, и является плазмидой pGEMT3-ΔPRT, депонированной в Бельгийской координационной коллекции микроорганизмов. (DCCM LMBP-Collection) 8 ноября 1996 г. под LMBP3590.

20. Способ по любому из пп.1 - 6 и 7 - 19, отличающийся тем, что трансфекцию осуществляют путем электропорации.

21. Способ по любому из пп.1 - 6 и 7 - 19, отличающийся тем, что трансфекцию осуществляют с использованием катионных липидов.

22. Способ по любому из пп.1 - 6 и 7 - 21, отличающийся тем, что фенотипическую лекарственную чувствительность химерных вирусов к различным ингибиторам обратной транскриптазы, протеазы и интегразы определяют автоматизированным анализом в клетках.

23. Способ по любому из пп.1 - 6 и 7 - 22, отличающийся тем, что фенотипическую лекарственную чувствительность химерных вирусов и штамм ВИЧ дикого типа к одному или более ингибиторам обратной транскриптазы, протеазы или интегразы выражают ингибирующей концентрацией (величиной IC).

24. Способ по любому из пп.1 - 6 и 7 - 23, отличающийся тем, что ингибиторы обратной транскриптазы отбирают из таких нуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы, как AЗT, dd1, ddC, 3TC, d4T, таких ненуклеозидных ингибиторов обратной транскриптазы, как ловирид, невирапин и тивирапин, таких ингибиторов протеазы, как сагинавир, индинавир и ритонавир, и таких ингибиторов интегразы, как фенилэтиловый эфир кофеиновой кислоты (CAPE).

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28