Способ определения иммуноглобулинов в сыворотке молозива

 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности, к методам исследования белков. Способ включает осаждение иммуноглобулинов сульфатом цинка. После осаждения пробы инкубируют в течение 50-53 мин при 17-20^oС, центрифугируют 7-10 мин при 2500-3000 об./мин, осадок промывают дистиллированной водой и центрифугируют 13-15 мин при 2500-3000 об./мин, полученный осадок высушивают. Затем последовательно добавляют 6-8 мл дистиллированной воды, 1-1,5 мл гидроксида натрия, 0,3-0,5 мл сульфата меди, выдерживают для развития цветной реакции, уплотняют центрифугированием и определяют экстинцию надосадочной жидкости. Расчет количества иммуноглобулинов проводят по калибровочному графику, построенному по результатам исследования аналогичным способом серии растворов стандартной сыворотки. Способ позволяет количественно определить уровень иммуноглобулинов в сыворотке молозива. 1 ил.

Изобретение относится к ветеринарии в частности, к методам исследования белков, и может использоваться для диагностики иммунологического статуса маточного поголовья.

Известен экспресс-метод определения иммуноглобулинов в сыворотке молозива, заключающийся в том, что количество иммунных белков оценивается по степени мутности исследуемых проб, которую измеряют фотонефелометрически (Костына М.А., Проблемы повышения резистентности животных - Cборник научных трудов ВНИИ незаразных болезней животных, г. Воронеж, 1983 г.).

Недостатком данного метода является его низкая чувствительность; фотоэлектроколориметр способен улавливать наименьшую концентрацию иммуноглобулинов в сыворотке крови или молозиве лишь на уровне 20-80 мг/%, что не позволяет всесторонне оценивать насыщенность молозива иммунными белками.

За прототип взят способ определения иммунных белков сыворотки крови по реакции помутнения, заключающийся в том, что при внесении в раствор, содержащий иммунные белки, сульфата цинка, происходят изменения в белковой молекуле и раствор мутнеет (М.С. Evan et al. Clinical chemical acta. Amsterdam, 1970. v.27, N 1-3. - P.155).

Недостатком данного способа является то, что концентрация иммуноглобулинов выражается в единицах мутности, характеризующих степень наличия иммунных белков без их количественного содержания, что недостаточно для научных исследований.

Для устранения вышеперечисленных недостатков предлагается способ количественного определения иммуноглобулинов в сыворотке молозива, включающий осаждение иммуноглобулинов сульфатом цинка, инкубирование пробы в течение 50-53 мин при 17-20^oC, центрифугирование 7-10 мин при 2500-3000 об./мин, промывание осадка дистиллированной водой с последующим центрифугированием в течение 13-15 мин при 2500-3000 об./мин. Полученный осадок высушивают, а затем последовательно добавляют 6-8 мл дистиллированной воды, 1-1,5 мл гидроксида натрия, 0,3-0,5 мл сульфата меди, выдерживают 55-60 мин для развития цветной реакции, уплотняют центрифугированием и определяют экстинцию надосадочной жидкости. Расчет количества иммуноглобулинов проводят по калибровочному графику, построенному по результатам исследования аналогичным способом серии растворов стандартной сыворотки. Инкубирование проб менее 50 мин недостаточно для полного осаждения иммуноглобулинов. Начиная с 50 до 53 мин, происходит осаждение иммунных белков, способствует этому и температура 17-20^oC. Центрифугирование в течение 7-10 мин при 2500-3000 об./мин способствует дополнительному выпадению в осадок иммунных белков. Промывка дистиллированной водой удаляет ненужные соединения. Второе центрифугирование способствует более полному выпадению иммунных белков в осадок. Добавление к осадку дистиллированной воды, гидроксида натрия и сульфата меди позволяет развиться цветной реакции, а выдерживание в течение 55-60 мин приводит к ее полному развитию.

Пример. В три центрифужные пробирки с 0,1 мл сыворотки молозива разного удоя внесли 6 мл 0,0208% раствора сульфата цинка, перемешали и инкубировали в термостате 53 мин при 20^oC. Затем содержимое пробирок центрифугировали 10 мин при 3000 об./мин. Надосадочную жидкость слили, а к осадку прилили 10 мл дистиллированной воды, перемешали и центрифугировали при 3000 об./мин. Надосадочную жидкость слили, осадок высушили над фильтровальной бумагой. Далее к осадку последовательно добавили 8 мл дистиллированной воды, 1,5 мл 18%-ного раствора гидроксида натрия, 0,5 мл 10%-ного раствора сульфата меди. Пробирки закрыли, встряхнули до получения равномерной смеси, выдержали 60 мин при комнатной температуре для развития цветной реакции, после чего содержимое пробирок центрифугировали 5 мин при 2000 об./мин для уплотнения осадка. Спектрофотометрировали надосадочную жидкость при длине волны 540 нм в кюветах с длиной оптического пути 10 мм.

1-я пробирка (молозиво 1-го удоя) - 0,270; 2-я пробирка (молозиво 2-го удоя) - 0,150; 3-я пробирка (молозиво 3-го удоя) - 0,120.

По приведенному калибровочному графику (см. чертеж) определяем количество иммуноглобулинов в пробах. Содержание иммуноглобулинов в молозиве составило: 1-я проба - 80,2 г/л; 2-я проба - 44,9 г/л; 3-я проба - 33,1 г/л.

Пониженное содержание иммуноглобулинов в молозиве менее 30,2 г/л способствует высокой заболеваемости, а нередко и гибели новорожденных животных. По-видимому, это обусловлено слабой биологической защитой и качеством молозива, отражающим пониженный иммунологический статус матерей, а следовательно, и приплода.

Способ позволяет количественно определять уровень иммуноглобулинов в сыворотке молозива и составить точное представление об иммунобиологическом статусе маточного поголовья.

Формула изобретения

Способ определения иммуноглобулинов в сыворотке молозива, включающий осаждение иммуноглобулинов сульфатом цинка, отличающийся тем, что после осаждения пробы инкубируют в течение 50-53 мин при 17-20^oC, центрифугируют 7-10 мин при 2500-3000 об./мин, осадок промывают дистиллированной водой и центрифугируют 13-15 мин при 2500-3000 об./мин, полученный осадок высушивают, а затем последовательно добавляют 6-8 мл дистиллированной воды, 1-1,5 мл гидроксида натрия, 0,3-0,5 мл сульфата меди, выдерживают для развития цветной реакции, уплотняют центрифугированием и определяют экстинцию надосадочной жидкости, расчет количества иммуноглобулинов проводят по калибровочному графику, построенному по результатам исследования аналогичным способом серии растворов стандартной сыворотки.

РИСУНКИ

Рисунок 1