Способ получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота

 

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к способам получения антигена вируса лейкоза (ВЛКРС) для серологической диагностики болезни. Способ состоит в 2-5-кратном разделении концентрата бессывороточной культуральной жидкости линии клеток, продуцирующих вирус лейкоза крупного рогатого скота, в двухфазной системе. Способ позволяет получать более специфичный и стабильный антиген ВЛКРС и увеличить его выход.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к способам получения антигена вируса лейкоза (ВЛКРС) для серологической диагностики болезни.

Лейкоз крупного рогатого скота относится к опухолевым заболеваниям вирусной этиологии.

Материалы официальной ветеринарной статистики за последние годы свидетельствуют о повсеместном распространении лейкоза крупного рогатого скота в РФ. В 45 из 75 субъектов РФ уровень инфицирования крупного рогатого скота вирусом лейкоза (ВЛКРС) составляет 10-50%. В предыдущем пятилетии лейкоз вышел на первое место в структуре инфекционной патологии.

Это заболевание наносит существенный ущерб животноводству, складывающийся из гибели животных и утилизации пораженных туш, преждевременной выбраковки скота, недополучения молодняка и молочной продукции, ограничения племпродажи. Особенно ощутимый ущерб наносится племенному генофонду высокопродуктивного скота.

Таким образом, проблема лейкоза крупного рогатого скота остается чрезвычайно актуальной.

Известны способы получения антигена вируса лейкоза с использованием фазовых систем декстран - полиэтиленгликоль(ПЭГ), сульфат декстрана - ПЭГ, сульфат декстрана - поливиниловый спирт, сульфат декстрана - метилцеллюлоза [1].

В задачу наших исследований входило разработать способ получения более специфичного и стабильного препарата антигена, осуществимого в промышленном производстве.

Предложенный способ получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота заключается в следующем.

Вируспродуцирующую культуру выращивают на ростовой среде, дополненной 5-20% сыворотки крови животных. По окончании формирования клеточного монослоя ростовую среду собирают и используют для выделения антигена ВЛКРС одним из существующих способов, а выросший монослой переводят на поддерживающую среду, отличающуюся от ростовой отсутствием каких-либо сывороточных добавок. В дальнейшем смену поддерживающей среды проводят 3-4 раза каждые 1-5 дней. Полученную бессывороточную культуральную жидкость осветляют фильтрованием или центрифугированием при 5000-10000 об/мин в течение 20-30 мин, добавляют 10^-4 моль/л фенилметилсульфонилфторида и проводят предварительное 50-100-кратное концентрирование культуральной жидкости через мембраны с пределом задержания 15000 Д или обрабатывают без предварительного концентрирования следующим образом.

К антигенсодержащей жидкости добавляют 5-10% ПЭГ 6000 и 0,3-0,5 моль/л NaCl, растворяют при перемешивании, выдерживают в течение 16-24 ч при 4^oС, образовавшийся осадок отделяют центрифугированием и ресуспендируют в забуференном фосфатами физиологическом растворе в объеме, равном 0,1-0,001 первоначального. Полученную суспензию подвергают разделению в фазовой системе ПЭГ - K₂HРО₄. Для этого к антигенсодержащей суспензии добавляют 7,0-7,6% ПЭГ 6000 и 14-16% K₂HPO₄, растворяют при перемешивании, выдерживают 3-24 часа при 4-20^oС для разделения фаз, верхнюю фазу отделяют и центрифугируют при 8000-10000 об/мин в течение 20-30 мин. Осадок и интерфазу ресуспендируют в нижней фазе, добавляют 0,3-0,4 объема 7,0-7,6% водного раствора ПЭГ 6000 и повторяют процедуру фазового разделения в этом режиме 2-4 раза. Верхние фазы объединяют, осветляют центрифугированием в указанном выше режиме и проводят 1-2-кратную обработку следующим образом: смешивают с трехкратным объемом 18-21% водного раствора K₂HPO₄, оставляют для разделения фаз на 3-24 ч при 4-20^oС, отделяют верхнюю фазу. Полученный продукт осветляют центрифугированием и используют в качестве антигена ВЛКРС в серологических реакциях.

Пример 1. Для изготовления 1000 диагностических доз антигена берут 1 л культуральной жидкости, полученной при культивировании вируспродуцирующей культуры на бессывороточной поддерживающей среде, осветляют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 30 мин, к супернатанту добавляют 10^-4 моль/л фенилметилсульфонилфторида, 0,02% азида натрия, 0,5 моль/л NaCl и 10% ПЭГ 6000, растворяют при перемешивании и оставляют при 4^oС на 16 ч. Центрифугируют при 5000 об/мин в течение 30 мин, супернатант отделяют, осадок ресуспендируют в 5 мл фосфатно-солевого буфера и добавляют 7% ПЭГ 6000 и 14,5% K₂HPO₄, перемешивают до полного растворения, оставляют на 3 ч при ^oС, отделяют верхнюю фазу от нижней фазы и интерфазы. Центрифугируют верхнюю фазу при 10000 об/мин 20 мин, отделяют супернатант. Полученный осадок объединяют с нижней фазой и интерфазой, добавляют 0,3 объема 7% раствора ПЭГ 6000, перемешивают и оставляют на 2 ч для разделения фаз. Отделяют и осветляют верхнюю фазу. Повторяют фракционирование нижней фазы, интерфазы и осадков, полученных после осветления верхней фазы в том же режиме еще 2 раза. Верхние фазы объединяют, добавляют трехкратный объем 20% раствора К₂НРO₄, перемешивают, оставляют на 5 ч при 4^oС и после разделения фаз отделяют верхнюю фазу, которую после осветления в указанном выше режиме используют в качестве антигена для ИФА. Полученный антиген в рабочем разведении обеспечивает выявление с дискриминирующим показателем P/N: сильноположительной контрольной сыворотки - 35,0, слабоположительной контрольной сыворотки (контроль чувствительности) - не ниже 3,0.

Пример 2. Для изготовления 80000 диагностических доз антигена ВЛКРС 100 л культуральной жидкости, полученной при культивировании антигенпродуцирующей культуры, концентрируют на ультрафильтрационных установках УПВ 6/3 с пределом задержания более 15000 дальтон до объема, равного 0,01 первоначального, добавляют 10^-4 моль/л фенилметилсульфонилфторида и 0,02% азида натрия, осветляют центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин, добавляют 10% ПЭГ 6000 и 0,5 моль/л NaCl, растворяют при перемешивании и оставляют на 20 ч при 4^oС. Отделяют осадок центрифугированием в течение 30 мин при 5000 об/мин, ресуспендируют в минимальном объеме забуференного фосфатами физиологического раствора хлорида натрия, рН 7,2, добавляют 7,6% ПЭГ 6000 и 16% K₂HPO₄, растворяют при перемешивании, оставляют на 16 ч при 4^oС, отделяют верхнюю фазу. Центрифугируют верхнюю фазу при 10000 об/мин 20 мин, отделяют супернатант. Полученный осадок объединяют с нижней фазой, добавляют 0,4 объема 7% раствора ПЭГ 6000, перемешивают и оставляют на 3 ч для разделения фаз. Отделяют и осветляют верхнюю фазу. Нижнюю фазу объединяют с интерфазой и осадком, полученным при осветлении нижней фазы, и подвергают фракционированию в этом же режиме еще 3 раза, отделяя и объединяя верхние фазы. Верхние фазы объединяют, добавляют трехкратный объем 20%-ного водного раствора К₂НРO₄, перемешивают, оставляют на 16 час при 4^oС, после разделения фаз отделяют верхнюю фазу и повторяют процедуру разделения, отделяя верхнюю фазу, которую после осветления в указанном выше режиме и добавления 10^-4 моль/л фенилметилсульфонилфторида и 0,02% азида натрия используют в качестве антигена для ИФА. Полученный антиген в рабочем разведении обеспечивает выявление с дискриминирующим показателем P/N: сильноположительной контрольной сыворотки - 30,0, слабоположительной контрольной сыворотки (контроль чувствительности) - не ниже 2,7.

Пример 3. Для изготовления 50000 диагностических доз антигена ВЛКРС 100 л культуральной жидкости, полученной при культивировании антигенпродуцирующей культуры, концентрируют на ультрафильтрационных установках УПВ 6/3 с пределом задержания более 15000 дальтон до объема, равного 0,01 первоначального, добавляют 10^-4 моль/л фенилметилсульфонилфторида и 0,02% азида натрия, осветляют центрифугированием при 5000 об/мин в течение 30 мин. К супернатанту добавляют 5% ПЭГ 6000 и 0,5 моль/л NaСl, растворяют при перемешивании, оставляют на 16 ч при 4^oС, отделяют образовавшийся осадок центрифугированием при 8000 об/мин в течение 20 мин, ресуспендируют его в минимальном объеме 0,85% раствора NaCl, добавляют 7% ПЭГ 6000 и 14,4% К₂НРO₄, растворяют при перемешивании, оставляют на 3 ч при 20^oС, отделяют верхнюю фазу, центрифугируют при 10000 об/мин 20 мин. Полученный осадок объединяют с нижней фазой и интерфазой, добавляют 0,3 объема 7% раствора ПЭГ 6000, перемешивают и оставляют на 3 ч для разделения фаз. Фракционирование осадков, интерфаз и нижних фаз проводят в этом режиме 3 раза, отделяя и объединяя верхние фазы. Объединенные верхние фазы осветляют центрифугированием в указанном выше режиме и дважды подвергают разделению в фазовой системе: добавляют трехкратный объем 18% К₂НРO₄, перемешивают, оставляют на 16 ч при 4^oС, отделяют верхнюю фазу. После осветления в указанном выше режиме верхнюю фазу второго разделения подвергают лиофильному высушиванию и затем используют в качестве антигена для ИФА. Полученный антиген в рабочем разведении обеспечивает выявление антител к гликопротеидному антигену вируса лейкоза у крупного рогатого скота, овец и кроликов, инокулированных рекомбинантным вирусом осповакцины, экспрессирующим наружный гликопротеид вируса лейкоза, с дискриминирующим показателем P/N не ниже 2,0.

Предложенный способ осуществим в промышленных масштабах, позволяет получить более специфичный и стабильный антиген ВЛКРС и увеличить его выход.

Антиген, полученный предложенным способом, апробирован нами в лабораторных условиях в 1992-1999 гг. при исследовании сывороток крови крупного рогатого скота из молочно-товарных хозяйств, а также в опытах по разработке вакцины против лейкоза крупного рогатого скота на основе покс-вирусного вектора, со встроенным геном env ВЛКРС. Результаты испытаний свидетельствуют о высокой специфичности антигена и наличии в его составе активного наружного гликопротеида ВЛКРС, что позволило эффективно выявлять антитела к антигенам вируса лейкоза в сыворотках крови как инфицированных ВЛКРС, так и инокулированных рекомбинантным вакцинным препаратом животных.

Антиген, полученный предложенным способом, найдет применение в производственных ветеринарных лабораториях и научно-исследовательских учреждениях при проведении серологического мониторинга эпизоотической ситуации и научных исследований при лейкозе крупного рогатого скота.

Источники информация 1. HAMMAR L., MERZA М., MALM К., ERIKSSON S., MOREIN В. The use of aqueous two-phase systems to concentrate and purify bovine leukemia virus outer envelope protein gp51. / Biotechnology and biochemistry. - 1989. - 11. - 296-306.

Формула изобретения

Способ получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота, включающий культивирование вируспродуцирующей культуры на ростовой среде с сывороткой крови, смену ростовой среды на поддерживающую, отделение культуральной жидкости с последующим ее концентрированием, отличающийся тем, что после концентрирования антигенсодержащее вещество подвергают 2-5-кратной очистке в фазовой системе, содержащей 7,0-7,6% ПЭГ 6000 и 14-16% К₂НРО₄, и верхнюю фазу используют в качестве антигена.