Способ изготовления инактивированной эмульгированной вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76 птиц

 

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной вирусологии. Используют вируссодержащую экстраэмбриональную жидкость утиных эмбрионов, зараженных вирусом ССЯ-76, штамм В-8/78. Инактивацию вирусного сырья проводят 1,8,3,6-диэндометилен-1,3,6,8-терроазатрициклодеканом из расчета 1,5-2,0 г препарата на 1000 см³. Титр гемагглютинина инактивированного вирусного сырья доводят до 1:4096 путем добавления стерильного забуференного физраствора или аналогичного вирусного сырья с большим титром гемагглютинина. К вирусному сырью добавляют адъювант на основе минерального масла. Полученную смесь пропускают через коллоидную мельницу. Полученную таким образом вакцину используют для вакцинации цыплят 110-дневного возраста. Внутримышечно вводили по 0,5 см³ вакцины. При наблюдении за цыплятами в течение 21 дня клинических признаков заболевания не отмечено, а в местах введения вакцины изменений не выявлено. Титры антител в сыворотках крови цыплят на 21 день после вакцинации составили 1:64 - 1:312, что свидетельствует об иммунном ответе, обеспечивающем 100% защиту.

Изобретение относится к биотехнологии и ветеринарной вирусологии, а именно к способам получения инактивированных эмбриональных эмульгированных вакцин против синдрома снижения яйценоскости - 76 (ССЯ-76), и может быть использовано в научных и производственных лабораториях при конструировании вакцин против ССЯ-76, а также на предприятиях биологической промышленности - при изготовлении указанных вакцин для профилактики этого заболевания.

Известны способы изготовления инактивированных вакцин против ССЯ-76, отличающиеся между собой используемыми инактиваторами (иминоэтиленимин, бис-этилениминоэтилоксамид), адъювантами (гидроокись алюминия, соевое масло с соевым лецитином).

Наиболее близким к предлагаемому способу изготовления инактивированной вакцины против ССЯ-76 является способ изготовления из производственного штамма В8/78 вируса ССЯ-76 с использованием в качестве инактиватора бис-этилениминоэтилоксамида, а адъювантом является соевое масло с соевым лецитином (патент 1809836, 1993 г.).

Использование бис-этилениминоэтилоксамида в качестве инактиватора вирусов имеет тот недостаток, что производные этиленамина являются алкилирующими агентами, активными мутагенами, высокотоксичны и огнеопасны ("Химический энциклопедический словарь", М., 1983 г., стр. 719). Адъювант включает соевое масло и лецитин, являющиеся пищевыми продуктами, что резко удорожает стоимость вакцины.

Целью изобретения является повышение надежности инактивации и стабильности вакцины против ССЯ-76 птиц с применением нового не токсичного инактиватора и масляного адъюванта.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе получения вакцины исключают инактивацию вакцинного штамма В8/78 вируса ССЯ-76 мутагенными и алкилирующими препаратами, а в качестве инактиватора используют 1.8.3.6. -диэндометилен-1.3.6.8. -тетроазатрициклодекан (торговое название теотропин), применяемый в качестве дезинфектанта (патент РФ 2123337), отличается тройной степенью очистки путем перекристаллизации из изопропилового спирта. Этот препарат представляет собой азотсодержащий дигомолог азаадамантана, который не токсичен, не обладает мутагенными, терратогенными, эмбриотоксичными и иммунодепрессантными действиями. Для этого берут вируссодержащую экстраэмбриональную жидкость утиных эмбрионов, зараженных вирусом ССЯ-76, штамм В8/78. Инактивацию вирусного сырья проводят 1.8.3.6.-диэндометилен-1.3.6.8-тетроазатрициклодеканом из расчета 1,5-2,0 г препарата на 1000 см³. Титр гемагглютинина инактивированного вирусного сырья доводят до 1:4096 путем добавления стерильного забуференного физраствора или аналогичного вирусного сырья с большим титром гемагглютинина. К вирусному сырью добавляют адъювант на основе минерального масла. Полученную смесь пропускают через коллоидную мельницу с зазором между статором и ротором "00".

Пример конкретного выполнения.

Для изготовления инактивированной вакцины против ССЯ-76 используют штамм В8/78 вируса ССЯ-76, которым заражают 9-11-дневные утиные эмбрионы (УЭ). Их помещают в термальную комнату и инкубируют при температуре 37,5^oС и относительной влажности 60-70% в течение 120 часов. Затем охлаждают при 4-6^oС в течение 12-24 часов и отбирают вируссодержащую экстраэмбриональную жидкость (ВСЭЭЖ). Гемагглютинирующая активность ВСЭЭЖ должна быть не ниже 1:16384. Вируссодержащий материал хранят при температуре не выше минус 25^oС и используют для приготовления вакцины в течение 30 дней со дня его наработки.

Производственную партию ВСЭЭЖ размораживают в водяной бане при температуре 18-20^oС и подвергают центрифугированию при 2500-3000 об/мин в течение 30 мин. Центрифугат (надосадочную жидкость) сливают в стерильные бутыли емкостью 10-20 дм³ и после перемешивания из каждой бутыли отбирают пробу вируссодержащей жидкости в количестве 3-4 см³ для проверки гемагглютинирующей активности вируса в РГА, который должен быть не ниже, чем 1:16384 (14 log 2).

Инактивацию вирусного материала ССЯ-76 проводят добавлением 1.8.3.6.-диэндометилен-1.3.6.8. -тетроазатрициклодеканом в очищенную и предварительно подогретую до температуры 37^oС ВСЭЭЖ, доводя конечную его концентрацию в вируссодержащей жидкости до 0,15-0,20%.

После осторожного перемешивания ВСЭЭЖ бутыли вместимостью 20, 30 дм³ оставляют при температуре 37^oС на 72 часа, осторожно перемешивая через каждые 5-6 часов. В процессе инактивации рН вируссодержащего материала должен быть в пределах 7,8-8,0. По истечении времени инактивации бутыли с вирусным антигеном из термостата переносят в стерильный бокс и доводят рН до 7,4-7,6 при помощи 5 М растворов уксусной кислоты или аммиака и после этого из каждой бутыли берут пробу антигена в количестве 3-4 см³ для контроля его авирулентности, стерильности и гемагглютинирующей активности. Вирусный антиген должен быть авирулентным, стерильным и иметь титр гемагглютинирующей активности не ниже, чем 1:8192 (13 log2). Вирусный антиген до использования хранят при температуре 2-6^oС не более 30 суток.

Перед составлением прописи готовой вакцины используемый вирусный антиген из бутылей перекачивают в реактор вместимостью 250-630 дм³ и проводят корректировку титра гемагглютинирующей активности (ГА), который должен быть 1: 4096 (12 log2). Если ГА титр антигена превышает это значение, его разбавляют стерильным 0,85% раствором хлористого натрия (NaС1) с рН 7,4-7,6, а если ГА титр ниже, то в этом случае добавляют вирусный антиген с более высоким титром гемагглютинирующей активности, добиваясь таким образом, чтобы титр ГА антигена перед эмульгированием был 1:4096.

В реактор с инактивированным антигеном вируса ССЯ-76 при включенной мешалке по закрытой системе медленно добавляют стерильный адъювант - 10%-ный раствор сапонина, доводя его конечную концентрацию в препарате до 0,15%, и минеральное масло (30%).

После постоянного перемешивания в течение 1-1,5 часов определяют рН изготовленной вакцины и при необходимости доводят его до 7,4-7,6 с помощью 5 М раствора уксусной кислоты или аммиака.

Затем из реактора отбирают пробу вакцины для контроля ее авирулентности, иммуногенности и стерильности. После чего реактор опечатывают и вакцину выдерживают при температуре 4^oС в течение 20 суток, периодически перемешивая по 5 мин через каждые 8 часов. По окончании проведения контроля на соответствие требованиям вакцину разливают во флаконы емкостью 250, 500 см³ в стерильных условиях.

Полученную таким способом вакцину использовали для вакцинации цыплят 110-дневного возраста. Внутримышечно вводили по 0,5 см³ вакцины. При наблюдении за цыплятами в течение 21 дня клинических признаков заболевания не отмечено, а в местах введения вакцины изменений не выявлено. Титры антител в сыворотках крови цыплят на 21 день после вакцинации составили от 1:64 до 1: 312, что свидетельствует о иммунном ответе, обеспечивающем 100% защиту. Требования ТУ предусматривают наличие антигемагглютинина не менее 1:16 через 21 сутки только у 80% вакцинированной птицы.

Формула изобретения

Способ изготовления инактивированной эмульгированной вакцины против синдрома снижения яйценоскости-76 птиц, включающий получение вируссодержащей экстраэмбриональной жидкости утиных эмбрионов, зараженных штаммом В-8/78 вируса синдрома снижения яйценоскости-76 птиц, инактивацию вирусного сырья, доведение титра гемагглютинина инактивированного вирусного сырья до 1: 4096, добавление адъюванта, приготовление эмульсии, отличающийся тем, что инактивацию вируса проводят 1.8.3.6-диэндометилен-1.3.6.8-тетроазатрициклодеканом из расчета 1,5-2 г препарата на 1000 см³ в течение 48 ч при 37^oС, а в качестве адъюванта применяют сапонин 0,15% и минеральное масло 30%.