Антигельминтное средство

 

Изобретение относится к области медицины и ветеринарии. Сущность изобретения: в качестве действующего вещества используют комплекс альбендазола и меди, дополнительно включенный в микрокапсулы из ацетилцеллюлозы при соотношении альбендазола, медного купороса и ацетилцеллюлозы в качестве исходных продуктов для получения препарата, равном 1:1:0,5 соответственно. Введение в состав антигельминтного средства металлокомплекса альбендазола позволяет повысить его терапевтическую активность, а включение металлокомплекса альбендазола в микрокапсулы из ацетилцеллюлозы обеспечивает пролонгированный целевой эффект, необходимый для радикальной химиотерапии ларвальных эхинококкозов. Средство обеспечивает полное угнетение роста ларвоцист эхинококка и гибель всей популяции паразита. 3 табл.

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, конкретно к медицинской и ветеринарной гельминтологии, и может быть использовано для лечения ларвальных эхинококкозов и других цестодозов, а также кишечных нематодозов человека и сельскохозяйственных животных.

Ларвальные эхинококкозы являются тяжелыми паразитарными заболеваниями человека и сельскохозяйственных животных, вызываемыми личинкой эхинококка и приводящими к гибели больных. Альвеолярный эхинококкоз (альвеококкоз) является заболеванием человека, а гидатидозный эхинококкоз - болезнь человека и сельскохозяйственных животных. Единственным радикальным методом лечения эхинококкозов до настоящего времени остается хирургический, малоэффективный в запущенных случаях заболевания. Радикальную операцию удается выполнить у 11-15% больных альвеококкозом и у 25-58% больных гидатидозным эхинококкозом; остальные больные в 93% случаев обречены на гибель в течение 10 лет после оперативного вмешательства. Но даже при успешно выполненной операции нередки случаи (3-54%) рецидива заболевания. Рецидивы приводят к необходимости повторных операций, производимых до 10 раз (Б.В. Петровский и соавт., 1985).

Первый лекарственный препарат для консервативного лечения ларвальных эхинококкозов был выявлен на экспериментальных моделях заболеваний в 1974 г. (А. И. Кротов и соавт., 1974). Применяемые с тех пор для химиотерапии ларвальных эхинококкозов препараты группы карбаматбензимидазолов - альбендазол (метил-5-[пропилтио] -2-бензимидазолкарбамат) и мебендазол (метиловый эфир 5-бензоил-2-бензимидазолкарбаминовой кислоты) способны угнетать рост паразита, не вызывая гибели всех или большинства ларвоцист эхинококка в экспериментальных и клинических условиях, что хотя и позволяет значительно продлить жизнь больного, но не гарантирует излечение пациента на протяжении всей его жизни. Наиболее трудно поддается химиотерапии альвеококкоз человека и экспериментально зараженных лабораторных животных. Самым устойчивым к химиотерапии оказался экспериментальный альвеококкоз хлопковых крыс, характеризующийся бурным ростом паразитарных ларвоцист и быстрой гибелью животных от инвазии (А.И. Кротов и соавт., 1974; P. Schantz et al., 1982).

В качестве прототипа избрана работа D. Taylor et al. (1988), которые предприняли попытку лечения экспериментального альвеококкоза хлопковых крыс наиболее эффективным в настоящее время противоэхинококковым препаратом альбендазолом. Хлопковым крысам с исходной длительностью экспериментальной инвазии в 1 мес. после внутрибрюшинного заражения зародышевыми элементами альвеококка вводили в желудок суспензию альбендазола в физиологическом растворе в суточной дозе действующего вещества (ДВ) 50 мг/кг в течение 1-6-месячных курсов (5 дней лечения с 2-дневным перерывом в течение каждой недели). Суммарная курсовая доза ДВ составляла 1,0-6,0 г/кг. После окончания лечения при вскрытии леченных и нелеченных контрольных животных установлено, что альбендазол вызвал лишь обратимое торможение роста ларвоцист альвеококка у леченных животных на 80,6-96,1% по сравнению с контролем, но не гибель паразита.

Недостатками прототипа являются: 1) низкая терапевтическая активность препарата (80,6-96,1%-ное торможение роста паразита, отсутствие ларвицидного эффекта); 2) недостаточная надежность критерия для оценки влияния препарата на рост паразита у леченных животных (но определялась интенсивность инвазии у крыс к моменту начала лечения; не указан точный срок вскрытия животных после окончания лечения).

Задачей изобретения является получение микрокапсулярной формы металлокомплекса альбенцазола с повышенной антигельминтной активностью при ларвальных альвеолярном и гидатидозном эхинококкозах.

Сущность изобретения состоит в тем, что в качестве ДВ антигельминтного средства используют комплекс альбендазола-субстанции (АС) и меди, дополнительно включенный в микрокапсулы из ацетилцеллюлозы при соотношении АС, медного купороса (МК) и ацетилцеллюлозы в качестве исходных продуктов для получения препарата, равном 1: 1: 0,5 соответственно. Введение в состав антигельминтного средства металлокомплекса альбендазола (МКА) в качестве ДВ повышает его терапевтическую активность по сравнению с токовой АС, а включение МКА в микрокапсулы из ацетилцеллюлозы обеспечивает пролонгированный целевой эффект, необходимый для радикальной химиотерапии ларвальных эхинококкозов.

Предлагаемое антигельминтное средство получают следующим образом. 0,5 частей ацетилцеллюлозы растворяют в 30 частях ацетона при нагревании и постоянном перемешивании. К полученному раствору добавляют 1 часть АС. Смесь перемешивают при нагревании в течение 1,5 час. К продукту реакции добавляют 1 часть растворенного в воде МК. Полученную смесь перемешивают при нагревании в течение 1 час. Затем к смеси добавляют 150 частей вазелинового масла, с которым перемешивают ее в течение 30 мин без нагревания. Из полученной смеси отгоняют ацетон при нагревании, неглубоком вакууме и постоянном перемешивании. Образовавшиеся микрокапсулы помещают на бумажный или стеклянный фильтр и под вакуумом отфильтровывают вазелиновое масло. Оставшиеся на фильтре микрокапсулы промывают 4-5 порциями по 30 частей в каждой гексана или петролейного эфира. Полученные микрокапсулы высушивают при нагревании в течение 4-5 час. Готовый продукт представляет собой гранулы шаровидной или овальной формы диаметром 100-200 мкм зеленоватого цвета без запаха и вкуса. Выход микрокапсул составляет 90-95%. Содержание ДВ, рассчитанное по связанному АС, составляет около 40%. Готовый продукт применяют в качестве антигельминтного средства внутрь в смеси с растительным маслом.

В отличие от АС, способного лишь временно подавлять развитие и рост ларвоцист эхинококка и не обладающего ларвицидным действием, микрокапсулированный МКА (МКМКА) не только полностью и стабильно подавляет рост ларвоцист эхинококка у хозяев паразита, но и вызывает гибель всей популяции эхинококка у леченных животных, обеспечивая радикальное излечение их от инвазии.

Получение и эффективность предлагаемого антигельминтного средства иллюстрируются следующими примерами.

Пример 1. МКМКА готовили следующим образом. 0,5 г ацетилцеллюлозы растворяли в 30 мл ацетона в трехгорлой реакционной колбе емкостью 0,5 л при 40-50^oС и постоянном перемешивании на магнитной мешалке со скоростью 300-350 об/мин. Через 30 мин в колбу помещали 1 г АС и смесь перемешивали при 40-45^oС в течение 1,5 час. Отдельно в химическом стакане емкостью 50 мл растворяли 1 г МК в 5 мл воды при 40^oС. После охлаждения раствора МК до 18-20^oС его помещали в делительную воронку емкостью 25 мл. Затем раствор МК прикапывали в реакционную колбу и полученную смесь перемешивали в течение 1 час при 40-50^oС. К концу экспозиции в колбу добавляли 150 мл вазелинового масла. Смесь перемешивали в течение 30 мин без нагревания. К колбе подключали водоструйный насос и при нагревании до 40-50^oС, неглубоком вакууме и постоянном перемешивании отгоняли ацетон. Образовавшиеся микрокапсулы выгружали из колбы на керамический с фильтровальной бумагой или стеклянный фильтр 1-2 и под вакуумом отфильтровывали вазелиновое масло. Оставшиеся на фильтре микрокапсулы промывали 4-5 порциями гексана или петролейного эфира по 30 мл в каждой порции. Вазелиновое масло и гексановые промывные фракции после перегонки собирали для повторного использования. Полученные микрокапсулы высушивали при 50^oС в течение 4-5 час. Высушенные микрокапсулы использовали в качестве антигельминтного средства в смеси с растительным маслом.

Терапевтическую активность МКМКА изучали при экспериментальном ларвальном альвеококкозе хлопковых крыс. В качестве препаратов сравнения использовали АС и МКА (приготовленный вышеописанным способом без добавления ацетилцеллюлозы). В тех же условиях эксперимента оценивали также эффективность полученных вышеуказанным способом двух образцов МКМКА, при получении которых соотношение исходных продуктов АС:МК:ацетилцеллюлоза составляло соответственно 1:1:0,4 и 1:1:0,6.

В опыте использованы хлопковые крысы-самцы, зараженные в возрасте 1-1,5 мес. внутрибрюшинно протосколексами и микроскопическими ацефалоцистами альвеококка Камчатского изолята (по 500 протосколексов и 100 ацефалоцист на 1 животное) от экспериментально зараженной хлопковой крысы-донора. Через 23 дня после заражения животные были разделены на 8 групп по 7-9 голов в каждой. Крыс первой группы вскрывали для определения исходной интенсивности инвазии (к моменту начала лечения). Средняя масса развившихся у них в брюшной полости ларвоцист альвеококка (ЛА) к этому сроку составляла 2,44 г на 1 крысу. Крыс 6-ти экспериментальных групп лечили МКМКА и препаратами сравнения. В контрольной группе были зараженные нелеченные животные.

Препараты вводили животным в смеси с рафинированным подсолнечным маслом или 1%-ным крахмальным гелем в желудок с помощью шприца и металлической канюли 1 раз в день в постепенно возраставших суточных дозах ДВ от 0,05 до 0,30 г/кг в течение 42-х дней без перерывов. Режим изменения суточных доз ДВ в течение курса лечения был следующим: I неделя - 0,05 г/кг, II неделя - 0,10 г/кг, III и IV недели - 0,20 г/кг, V и VI недели - 0,30 г/кг. Всех животных экспериментальных и контрольной групп вскрывали через 74 дня после заражения и определяли у каждого массу и жизнеспособность выявленных ЛА. Терапевтическую активность испытуемых препаратов определяли по показателю индекса химиотерапевтической активности (ИХТА) и данным микроскопического исследования нативных препаратов ЛА на наличие и выраженность деструктивных изменений зародышевых элементов паразита (протосколексов и ацефалоцист). ИХТА рассчитывали в процентах по формуле: ИХТА=(Мк-Мл)/(Мк-Ми)100, где Ми, Мк и Мл - средние значения массы ЛА на 1 животное исходной, у контрольных и леченных крыс соответственно.

Результаты эксперимента показали (табл.1), что наибольшей эффективностью обладал образец МКМКА, при получении которого соотношение АС : МК : ацетилцеллюлоза составляло соответственно 1:1:0,5 (ИХТА=100,3%; выраженная деструкция зародышевых элементов во всех ЛА у всех леченных животных). Образцы МКМКА, полученные при соотношении АС : МК : ацетилцеллюлоза 1:1:0,4 и 1:1: 0,6 были менее эффективными (ИХТА=95,9 и 93,1% соответственно) и не вызвали гибели всех зародышевых элементов в ЛА у леченных крыс. Далее в ряду снижения эффективности располагались МКА (ИХТА=84,3%), АС (ИХТА=72,0%), испытанные в одинаковых условиях в смеси с растительным маслом. Самая низкая терапевтическая активность отмечена у АС, вводимого в крахмальном геле (ИХТА= 48,4%). При этом у крыс, леченных АС с растительным маслом и крахмальным гелем, большинство зародышевых элементов в ЛА сохраняло жизнеспособность.

Пример 2. МКМКА получали так же, как в примере 1 при соотношении АС:МК: ацетилцеллюлоза, равном 1:1:0,5 соответственно. Терапевтическую активность МКМКА изучали при ларвальном альвеококкозе белых мышей на поздней стадии инвазии.

В опыте использованы аутбредные мыши-самцы, зараженные в возрасте 1,5 мес. внутрибрюшинно протосколексами и ацефалоцистами Казахстанского изолята (по 1000 протосколексов и 200 ацефалоцист на 1 животное). Через 121 день после заражения были вскрыты 5 мышей для определения исходной интенсивности инвазии. К этому сроку показатель Ми был равен 7,65 г на 1 мышь. 8-ми мышам экспериментальной группы вводили МКМКА в смеси с рафинированным подсолнечным маслом в желудок 1 раз в день в течение двух 10-дневных курсов в постепенно возраставших суточных дозах ДВ от 0,05 до 0,24 г/кг с интервалом между курсами в 15 дней. Общая продолжительность лечения составила 35 дней (со 122-го по 157-й дни после заражения). Суммарная доза ДВ была равна 2,45 г/кг. 12 зараженных не леченых мышей служили контролем. Мышей экспериментальной группы вскрывали через 198 дней после заражения (42 дня после окончания лечения). Мышей контрольной группы вскрывали по мере их естественного падежа от альвеококкоза, а выживших животных - в тот же день, что и мышей экспериментальной группы. Терапевтическую активность МКМКА оценивали так же, как и в примере 1.

Результаты эксперимента показали (табл. 2), что МКМКА проявил высокую терапевтическую активность, о чем свидетельствовали полное угнетение роста и коллапс ЛА (ИХТА= 183,5%), а также гибель всех ЛА. При вскрытии у леченных мышей конгломераты ЛА были представлены аморфными бесструктурными образованиями желтого цвета, фрагментирующимися при попытке извлечения их из брюшной полости животных. При микроскопии содержимого этих образований, представленного казеозным детритом, выявлено множество деформированных или разрушенных протосколексов и ацефалоцист с далеко зашедшими деструктивными изменениями. Данные микроскопии свидетельствовали о том, что гибель ЛА у леченных животных наступила гораздо раньше срока вскрытия животных. Масса некротизированных ЛА у леченных животных варьировала от 3,04 до 7,13 г и составляла в среднем 4,16 г на 1 мышь. Надежность радикального терапевтического эффекта МКМКА подтвердил отдаленный срок вскрытия леченных животных после окончания лечения (около 1,5 мес. ). Из 12-ти контрольных мышей 10 животных пали от альвеококкоза через 146-187 дней после заражения. ЛА у животных контрольной группы были представлены преимущественно зрелыми, интенсивно почкующимися формами, содержавшими множество живых протосколексов и ацефалоцист. Масса ЛА у контрольных мышей составляла в среднем 11,83 г на 1 животное.

Пример 3. МКМКА получали так же, как в примере 1 при соотношении АС : МК : ацетилцеллюлоза, равном 1:1:0,5 соответственно. Терапевтическую активность МКМКА изучали при ларвальном гидатидозном эхинококкозе белых крыс на поздней стадии инвазии.

Модель инвазии воспроизводили у молодых аутбредных крыс обоего пола массой тела 140-180 г путем оперативной внутрибрюшинной имплантации ларвоцист гидатидозного эхинококка (ЛГЭ) от аутбредных мышей-доноров, зараженных внутрибрюшинно протосколексами из ЛГЭ от оперированного человека и вскрытых через 15 мес. после заражения. 7-ми крысам-реципиентам, меченным индивидуальной меткой, имплантировали внутрибрюшинно зрелые ЛГЭ (содержавшие визуально различимые выводковые капсулы с протосколексами на внутренней поверхности слоистой оболочки). Операцию выполняли под эфирным наркозом; переднюю брюшную стенку крыс рассекали послойно по средней линии от мечевидного отростка (длина разреза - 3-4 см), донорские ЛГЭ вводили в брюшную полость и послойно зашивали брюшную стенку. Для профилактики перитонита животным вводили внутрибрюшинно однократно по 5 мл физиологического раствора с антибиотиками (2000 ЕД/мл пенициллина и 0,3 мг/мл гентамицина. 4-м крысам экспериментальной группы через 119 дней после оперативной имплантации 1-4 ЛГЭ диаметром 11-18 мм вводили МКМКА в смеси с подсолнечным маслом в желудок 1 раз в день в течение одного 6-дневного курса в постепенно возраставших суточных дозах ДВ от 0,05 до 0,15 г/кг (суммарная курсовая доза ДВ - 0,6 г/кг). 3 нелеченные крысы, которым имплантировали в брюшную полость по 1-3 ЛГЭ диаметром 11-21 мм, служили контролем. Эффективность лечения оценивали путем ультразвукового исследования (УЗИ) каждой крысы экспериментальной и контрольной групп с помощью ультразвукового сканера Acuson-512 (США) через 119 и 156 дней после заражения и по данным макро- и микроскопического исследования нативных ЛГЭ при вскрытии животных обеих групп, проведенном через 182 дня после заражения.

Результаты эксперимента показали (табл. 3), что МКМКА вызвал гибель и последующий коллапс всех ЛГЭ у всех леченных животных. Показатели УЗИ брюшной полости крыс экспериментальной группы в день начала лечения и через 37 дней после окончания курса лечения свидетельствовали о выраженном нарушении структуры ЛГЭ (уменьшение объема, изменение формы, размытость контуров ЛГЭ, появление плотных включений в их полости, отслоение паренхимного слоя от кутикулярной оболочки). У одного леченного животного (крыса 4) УЗИ не выявило одну из 4-х имплантированных ЛГЭ через 37 дней после окончания лечения, тогда как в день начала лечения этим методом выявлялись все имплантированные ЛГЭ (признак полной потери гидатидной жидкости в результате коллапса ЛГЭ). УЗИ контрольных крыс не выявило деструктивных изменений у всех имплантированных ЛГЭ. Высокую информативность УЗИ подтвердили результаты макро- и микроскопического исследования ЛГЭ у леченных и контрольных крыс при вскрытии животных через 6 мес. после заражения. У крыс экспериментальной группы, вскрытых через 2 мес. после окончания курса лечения, все ЛГЭ были полностью спавшимися и содержали погибшие и разрушенные протосколексы. У контрольных животных все ЛГЭ были живыми, имели нормальный тургор и содержали выводковые капсулы с живыми зрелыми ввернутыми протосколексами (по 2-16 протосколексов в каждой выводковой капсуле).

Таким образом, микрокапсулированный металлокомплекс альбендазола с соотношением альбендазол: медный купорос: ацетилцеллюлоза в качестве исходных продуктов для получения препарата, равным 1:1:0,5, соответственно обладает повышенной эффективностью в отношении не поддающихся радикальной химиотерапии ларвальных эхинококкозов (полное угнетение роста ларвоцист эхинококка, губительное действие на всю популяцию паразита у инвазированного хозяина) в сравнении с таковой наиболее эффективного до настоящего времени противоэхинококкового препарата альбендазола (81-96%-ное торможение роста паразита, отсутствие ларвицидного эффекта), что свидетельствует о большей биодоступности заявляемого средства. Известно, что альбендазол и другие препараты, представляющие группу карбаматбензимидазолов, применяются при лечении не только эхинококкозов, но и других ларвальных цестодозов, являясь прежде всего эффективными средствами при кишечных нематодозах человека и сельскохозяйственных животных. Однако наряду с ларвальными цестодозами, некоторые кишечные нематодозы (трихоцефалез в клинических, и особенно в экспериментальных условиях) плохо поддаются химиотерапии этими препаратами. Ввиду этого применение предлагаемого антигельминтного средства позволит повысить эффективность химиотерапии ларвальных цестодозов и кишечных нематодозов человека и сельскохозяйственных животных.

Источники информации, принятые во внимание при составлении заявки: 1. Taylor D.H., Morris D.L., Richards K.S., Reffin D. Echinococcus multilocularis: in vivo results with albendazole and praziquantel. Trans. Roy. Soc. Trop. Med. and Hyg., 1988, v. 82, 4, р. 611-615 (прототип).

2. Кротов А.И., Черняева А.И., Коваленко Ф.П., Баяндина Д.Г., Буданова И.С., Кузнецова О.Е., Воскобойник Л.В. Экспериментальная терапия альвеококкоза. Сообщение II. Эффективность при альвеококкозе лабораторных животных некоторых противонематодных средств. Мед. паразитол. и паразитарн. болезни, 1974, 3, с. 314-319.

3. Петровский Б.В., Милонов О.Б., Дееничин П.Г. Хирургия эхинококкоза, 1985, М., 216 с.

4. Schantz P. M., Van den Bosche H., Eckert J. Chemotherapy for larval echinococcosis in animals and humans. Report of a workshop. Z. Parasitenkd., 1982, v. 67, p. 5-26.

Формула изобретения

Антигельминтное средство, включающее бензимидазолкарбамат, отличающееся тем, что в качестве действующего вещества оно содержит комплекс альбендазола и меди, который дополнительно включен в микрокапсулы из ацетилцеллюлозы при соотношении альдендазола, медного купороса и ацетилцеллюлозы 1: 1: 0,5 соответственно в качестве исходных продуктов для его получения.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3