Способ выявления вирусной составляющей в оценке гепатоцеребральной дистрофии

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к способу выявления вирусной составляющей в этиологии гепатоцеребральной дистрофии (ГЦД). Сущность изобретения состоит в том, что дополнительно проводят морфологическое исследование биоптата печени, выявляют наличие матово-стекловидных гепатоцитов и при уровне их более 10-ти на 100 гепатоцитов в поле зрения светового микроскопа при малом увеличении выявляют вирусную составляющую в этиопатогенезе ГЦД. Предлагаемый метод значительно повышает качество диагностики, профилактики и лечения больных ГЦД и способствует более точному пониманию причины поражения печени и адекватно оценивать общее состояние пациента при болезни Вильсона-Коновалова.

Изобретение относится к области медицины, в частности к способу выявления вирусной составляющей в оценке этиопатогенеза гепатоцеребральной дистрофии (ГЦД).

Гепатоцеребральная дистрофия (болезнь Вильсона-Коновалова) - наследственное заболевание, возникающее обычно в возрасте от 10 до 35 лет и характеризующееся нарушением синтеза белков и обмена меди, прогрессирующим поражением подкорковых ганглиев и печени. В настоящее время этиопатогенез заболевания достаточно хорошо известен. ГЦД - это наследственное нарушение синтеза медьсвязывающего протеина - церулоплазмина, в результате которого возникает избыточное накопление токсических доз меди в подкорковых ганглиях, печени, почках. Морфологические изменения нервной системы представлены дегенерацией ганглиозных клеток и разрастанием нейроглии. При компьютерной томографии обнаруживается диффузная атрофия мозга и очаги пониженной плотности в области базальных ганглиев примерно у половины леченых больных. Поражение печени носит характер узлового цирроза, которому сопутствует спленомегалия. Отложение меди по периферии роговицы лежит в основе специфического признака болезни - роговичного кольца Кайзера-Флейшера [1].

Современные исследования позволили расшифровать ген (нуклеотидную последовательность), дефектный при ГЦД (болезни Вильсона-Коновалова) [2], а также ген, кодирующий нормальный белок, который предотвращает развитие ГЦД [3].

Однако для практических целей эти методы пока не реальны для использования. Кроме того, большую проблему представляют собой патологические изменения печени при ГЦД, работа над которой является весьма актуальной.

При оценке клинических проявлений ГЦД выявляется полиморфизм, различная степень тяжести и вариабельность нарушения функции печени. Несмотря на большое количество изучаемых показателей и диагностических проб, до сих пор отсутствуют надежные диагностические тесты для выявления причин различных вариантов повреждения печени при ГЦД: от весьма умеренного до тяжелого цирроза печени, иногда с фульминантным течением, приводящим к быстрой гибели больных [4].

Технической задачей настоящего изобретения является выявление вирусной составляющей в этиопатогенезе ГЦД, повышение эффективности и надежности морфо-лабораторной диагностики причин и характера повреждений печени при ГЦД.

Поставленная задача решается с помощью выявления уровня гепатоцитов, имеющих матово-стекловидную цитоплазму в биоптате печени и при наличии более 10-ти матово-стекловидных из 100 гепатоцитов в поле зрения при малом увеличении, определяют вирусную составляющую в оценке поражения печени при болезни Вильсона-Коновалова.

Технический результат изобретения заключается в возможности одновременно с выявлением традиционно существующей вильсоновской (генетической) причины поражения печени, определить также и присутствие вирусного фактора. Известные иммуноморфологические методы исследования маркеров вирусного поражения печени связаны с радиоиммунологическими, иммуноферментными анализами, а также с использованием полимеразной цепной реакциии и т.п., которые проводятся с использованием крови и ее компонентов (см., например, патент РФ 2133622, 1999). Перечисленные известные методы специфичны, точны и чувствительны при достаточно высоких титрах соответствующих выявляемых субстанций. К недостаткам же их относится, прежде всего, высокая стоимость проведения анализов, связанная с использованием дорогостоящего оборудования и реактивов. Помимо прочего иммунологические методы диагностики требуют забора венозной крови, что создает определенный риск заражения инфекционными заболеваниями (синдром приобретенного иммунодефицита, гепатиты) как лабораторного персонала, так и сотрудников занятых в этом обследовании.

Изобретение осуществляют следующим образом: У пациента берут биоптат ткани печени с целью уточнения ее поражения при болезни Вильсона-Коновалова.

В соответствии с общепринятыми методами гистологической обработки биоптат ткани печени подвергается обезвоживанию в спиртах восходящей крепости, начиная с 70^o спирта. В соответствии с выбранной проводкой ткани приготавливают парафиновые целлоидиновые или целлоидин-парафиновые блоки ткани печени. На микротоме приготавливают срезы ткани толщиной 5-6 мкм, окрашивают гематоксилином и эозином.

С помощью светового микроскопа при стандартных малых увеличениях (окуляр 7, объектив 10, 15, 20) проводят гистологическое исследование препаратов ткани печени с целью выявления патологических изменений.

При обнаружении в поле светового микроскопа 10-ти и более матово-стекловидных на 100 гепатоцитов в поле зрения при малом увеличении выявляют вирусную составляющую в поражении печени при ГЦД.

Матово-стекловидные гепатоциты представляют собой увеличенные в объеме печеночные клетки с бледно окрашивающейся эозином цитоплазмой, напоминающей матовое стекло, которые выявляются при вирусных гепатитах. Ядро нередко сдвинуто к периферии клетки, но с обычными тинкториальными свойствами. Как правило, по периферии этих клеток имеется светлый ободок. Количество и локализация их в различных отделах печеночной дольки различны, хотя чаще они располагаются у портальных трактов и внутридольковых инфильтратов [5].

Выявление матово-стекловидных гепатоцитов уже при обычном обследовании в световом микроскопе гистологических препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, позволяет, прежде всего, заподозрить вирусное поражение печени, не прибегая к дорогостоящим электронно-микроскопическим и иммунологическим методам исследования. Если же обнаружение этих клеток сочетается с воспалительными изменениями, характерными для гепатита (наличие ступенчатых некрозов, лобулярных инфильтратов с ровными краями и гепатоцитов со сморщенной ацидофильной цитоплазмой и пикнотичным ядром), то сочетание подобных гистологических изменений считается специфичным для морфологической картины вирусных гепатитов.

Наши исследования показывают, что о наличии или подозрении вирусного поражения печени можно судить уже при исследовании обычных гистологических препаратов, окрашенных гематоксилином и эозином, т.е. без специальных дорогостоящих методов исследования. Выявление характерных морфологических изменений, а именно определенного уровня гепатоцитов с матово-стекловидной цитоплазмой, позволяет с определенной долей достоверности высказаться о дополнительных причинах патологического процесса в печени при ГЦД и дает возможность прицельно провести дорогостоящие иммунологические исследования. Нами впервые обнаружены, изучены и проанализированы в количественном плане матово-стекловидные гепатоциты при болезни Вильсона-Коновалова.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами: Пример 1. Больная Б. поступила с диагнозом - гепатоцеребральная дистрофия. Больной проведены биохимические исследования функциональных проб печени. Выявлены отклонения в уровне аминотрансфераз белково-осадочного спектра. Вирусные маркеры не обнаружены. При сцинтиграфии наблюдалось увеличение печени и повышенное включение изотопа в селезенке. Подобные исследования не носили дополнительной информации, уточняющей природу повреждения печени.

Выполнена пункциональная биопсия печени иглой Манчини с последующим морфологическим исследованием. Помимо морфологической картины лобулярного гепатита, который может возникать при различных причинных факторах, выявлены матово-стекловидные гепатоциты в количестве 10-12 на каждые 100 гепатоцитов.

Таким образом, наше обследование больной показало наличие вирусной составляющей в поражении печени при ГЦД, что в дальнейшем было подтверждено тонкими иммунохимическими методами (исследование ASV-антигена). Больной были проведены дополнительные адекватные диагностические, а затем и лечебные мероприятия.

Пример 2. Больная П. Н., 24 лет, поступила с диагнозом - аутоиммунный гепатит с жалобами на носовые кровотечения с 16 лет, тупые боли в правом подреберье, впервые появившуюся отечность на ногах, аменорею, асцит. Была начата соответствующая терапия.

В биохимических показателях функциональных проб печени умеренная билирубин-, фермент- и гаммаглобулинемия. Австралийский антиген отрицательный. При сцинтиграфии печени с технецием-99 выявлено повышенное включение изотопа в селезенку. Подобные изменения наблюдаются при различных формах поражения печени и не уточняют природу заболевания. У больной выявлены нарушения в обмене меди, выявлено кольцо Кайзера-Флейшера. Результат гистологического исследования пунктата печени: выявлены матово-стекловидные гепатоциты в количестве 14-17 на 100 гепатоцитов в поле зрения светового микроскопа при малом увеличении. Все эти исследования позволили установить наличие у больной ГЦД и, кроме того, выявить вирусную составляющую при оценке повреждения печени и оказать пациенту адекватную медицинскую помощь. Дальнейшие иммунохимические исследования подтвердили наличие вирусной составляющей при болезни Вильсона-Коновалова.

Пример 3. Больная Б., 28 лет, поступила с диагнозом ГЦД, ей проводилось лечение медьвыводящими препаратами. Жалобы на боли в правом подреберье и слабость. Гепатитом не болела. В биохимических исследованиях наблюдалась умеренная ферментемия, вирусные маркеры не обнаружены. При сцинтиграфии отмечалось повышенное накопление в селезенку, что наряду с другими отклонениями свидетельствовало в пользу повреждения печени. При морфологическом исследовании печени картина активного гепатита, выявлена группа гепатоцитов с цитоплазмой, напоминающей матово-стекловидную в количестве 15-20 на 100 гепатоцитов. Таким образом, помимо клинико-морфологической картины активного гепатита, выявленные матово-стекловидные гепатоциты дают возможность высказаться в пользу вирусной составляющей в этиологии ГЦД. Дополнительное иммунохимическое исследование на присутствие ASV-антигена подтвердило наличие вирусной составляющей при болезни Вильсона-Коновалова. Больной проведена адекватная гепатопротекторная терапия.

Предлагаемый метод значительно повышает качество диагностики и эффективности лечения больных ГЦД, способствует более точному пониманию причины поражения печени при болезни Вильсона-Коновалова.

Источники информации 1. "Гепатоцеребральная дистрофия", СД "Большая медицинская энциклопедия", 2000 г.

2. WO 95/08641, по кл. С 12 Q 1/68, 30.03.1995 г.

3. Патент США 5578493, по кл. С 12 N 15/12, 26.11.1996 г.

4. П. Г. Лекарь, В. А. Макарова "Гепатоцеребральная дистрофия". Л., "Медицина", 1984.

5. "Морфологическая диагностика заболеваний печени", М., "Медицина", 1989 г.

Формула изобретения

Способ выявления вирусной составляющей в оценке состояния пациента при гепатоцеребральной дистрофии (ГЦД) путем клинико-биохимического и морфологического исследования, отличающийся тем, что проводят дополнительное морфологическое исследование биоптата печени, выявляют уровень матово-стекловидных гепатоцитов и при уровне их более 10-ти на 100 гепатоцитов в поле зрения светового микроскопа при малом увеличении выявляют вирусную составляющую в оценке состояния пациента при болезни Вильсона - Коновалова (ГЦД).