Фосфорилированные полимеры и их конъюгаты

 

Изобретение относится к абсорбируемым сложным полиэфирам с по крайней мере одной монофосфатной группой в цепи абсорбируемого сложного полиэфира, где цепь сложного полиэфира включает один или более мономеров, выбранных из группы, состоящей из L-, D- или DL-молочной кислоты, яблочной, лимонной, винной, ε-капроновой кислот, алкиленоксалата, циклоалкиленоксалата, алкиленсукцината, β-гидроксибутирата, гликолида, гликолевой кислоты, L-, D-, DL- или мезолактида, триметиленкарбоната, p-диоксанона, 1,5- или 1,4-диоксепан-2-она и любых их оптически активных изомеров, рацематов или их сополимеров; твердым абсорбируемым микрочистицам, включающим абсорбируемый сложный полиэфир; ацилированным или алкилированным полисахаридам; конъюгатам, включающим указанные выше абсорбированный сложный полиэфир, микрочастицы, полисахариды и пептиды и/или биологически активные вещества; фармацевтическим композициям, способным к замедленному высвобождению биоактивного пептида, а также к способам получения фосфорилированного сложного полиэфира, фосфорилированного-алкилированного циклодекстрина, фосфорилированных микрочастиц, ацилированного-фосфорилированного полисахарида, а также к фосфорилированному-привитому-ацилированному циклодекстрину, способу его получения и конъюгату, включающему указанный циклодекстрин и пептид и/или биологически активное вещество. 19 с. и 7 з.п. ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к абсорбируемым сложным полиэфирам, включающим одну или более монофосфатную функциональную группу; к конъюгату, включающему указанные сложные полиэфиры и пептид и/или биологически активное вещество; к микрочастицам, включающим абсорбируемый сложный полиэфир; к конъюгату, включающему микрочастицы и пептид и/или биологически активное вещество; к ацилированному или алкилированному полисахариду, имеющему одну или более монофосфатных функциональных групп; к конъюгату, включающему ацилированный или алкилированный полисахарид и пептид и/или биологически активное вещество; и к их фармацевтическим композициям.

Содержащие фосфоргетероцепные полимеры упоминались в патентной и технической литературе в сочетании с (1) антипиреновыми и/или гидрофильными полиамидами (Shalaby, S.W., et al., J.Polym.Sci., Polym.Chem. Ed., 12, 2917 (1974): Shalaby, S. W. , et al. , J.Polym.Sci., Polym.Chem. Ed., 13, 669 (1975); Shalaby, S. W. , et al., J.Polym.Sci., Polym.Chem. Ed., 14, 2675 (1976); Shalaby, S.W. and McCaig, S., патент США 5491198; Shalaby, S.W. and Rogers, K. R., патент США 5558517): (2) антипиреновыми сложными полиэфирами (Heffner, R.E., патент США 4420587; Koch, P.J., et al., J.Appl. Polym.Sci., 19, 227 (1975); патент Японии 51-40432); (3) антипиреновыми полиуретанами и эпоксидными смолами (патент ФРГ 1292862, патент США 3321555); (4) термически устойчивыми сложными полиэфирами с концевыми группами цепи, реагирующими с фосфонилтиоцианатом (патент США 3838045); (5) фосфорилированной целлюлозой в качестве катионообменника (патент ГДР 286600) и (6) фосфорилированными сложными полиэфирами в качестве полупроводниковых материалов (патент СССР 672878). Однако, в известном уровне техники не раскрывается способ включения фосфатных групп по доступным участкам концевых гидроксильных групп абсорбируемых сложных полиэфиров, такие участки обычно присутствуют при одном или двух концах цепи. Это не удивительно, поскольку условия химических реакций, известные для фосфорилирования гидроксильной группы, могли вызвать гидролиз высокореакционноспособных цепей абсорбируемых сложных полиэфиров. Между тем, представляло большой интерес разработать содержащие карбоксильную группу абсорбируемые сложные полиэфиры для использования при образовании конъюгатов с биологически активными полипептидами в качестве систем для их контролируемого высвобождения (Shalaby, S.W., et al., патент США 5672659).

Поэтому имеется стимул изготовить непосредственно фосфорилированные абсорбируемые сложные полиэфиры, не вызывая существенного разложения цепи, с целью получения новых систем контролируемого высвобождения.

В одном аспекте настоящее изобретение относится к абсорбируемому сложному полиэфиру с, по крайней мере, одной монофосфатной функциональной группой в цепи абсорбируемого сложного полиэфира. Предпочтительным вариантом непосредственно вышеупомянутого абсорбируемого сложного полиэфира является такой, где цепь сложного полиэфира включает один или более мономеров, выбранных из группы, состоящей из L-молочной кислоты, D-молочной кислоты, DL-молочной кислоты, яблочной кислоты, лимонной кислоты, винной кислоты, ε-капролактона, ε-капроновой кислоты, алкиленоксалата, циклоалкиленоксалата, алкиленсукцината, β-гидроксибутирата, гликолида, гликолевой кислоты, L-лактида, D-лактида, DL-лактида, мезолактида, триметиленкарбоната, р-диоксанона, 1,5-диоксепан-2-она и 1,4-диоксепан-2-она и их любых оптически активных изомеров, рацематов или сополимеров. Наиболее предпочтительным вариантом осуществления вышеупомянутого изобретения является такой, когда абсорбируемый сложный полиэфир, кроме того, включает один или более сегментов полиэтиленгликоля, ковалентно присоединенных к сложному полиэфиру. Другой аспект вышеупомянутого изобретения состоит в том, что это изобретение относится к получению конъюгата, включающего вышеупомянутый абсорбируемый сложный полиэфир и пептид и/или биологически активное вещество, где пептид и биологически активное вещество имеют, по крайней мере, одну интерактивную аминогруппу, где монофосфатная функциональная группа образует связь с аминогруппой. Предпочтительным вариантом воплощения вышеупомянутого конъюгата является такой, где пептид выбирается из группы, состоящей из p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂, H-β-D-NaI-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂, где два остатка Cys связаны дисульфидной связью, N-гидроксиэтилпиперазинил-ацетил-D-Phe-Cys-Тyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, где два остатка Cys связаны дисульфидной связью, и N-гидрокси-этилпиперазинил-этилсульфонил-Рhe-Сys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, где два остатка Cys связаны дисульфидной связью, или его фармацевтически приемлемой соли.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к конъюгату, включающему абсорбируемый сложный полиэфир с, по крайней мере, одной монофосфатнсй функциональной группой в цепи абсорбируемого сложного полиэфира и пептид и/или биологически активное вещество, где пептид и биологически активное вещество имеют не менее одной интерактивной аминогруппы, где монофосфатная функциональная группа образует связь с аминогруппой. Предпочтительным является конъюгат, где пептид выбирается из группы, состоящей из p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂, H-β-D-NaI-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂, где два остатка Cys связаны дисульфидной связью, N-гидроксиэтилпиперазинил-ацетил-D-Phe-Cys-Тyr-D-Тrp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, где два остатка Cys связаны дисульфидной связью, и N-гидроксиэтилпиперазинил-этилсульфонил-Рhe-Сys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, где два остатка Cys связаны дисульфидной связью, или его фармацевтически приемлемая соль.

В другом аспекте настоящее изобретение относится к твердой абсорбируемой микрочастице, включающей абсорбируемый сложный полиэфир с, по крайней мере, одной монофосфатной функциональной группой в цепи абсорбируемого сложного полиэфира и имеющей поверхность, где на поверхности абсорбируемой микрочастицы находится более чем один процент монофосфатных функциональных групп. Дополнительным аспектом настоящего изобретения является конъюгат, включающий непосредственно вышеупомянутую абсорбируемую микрочастицу и пептид и/или биологически активное вещество, где пептид и биологически активное вещество имеют по меньшей мере одну интерактивную аминогруппу, где монофосфатная функциональная группа на поверхности абсорбируемой микрочастицы образует связь с аминогруппой. Предпочтительным вариантом осуществления непосредственно вышеупомянутого конъюгата является конъюгат, где пептид выбирается из группы, состоящей из р-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂, H-β-D-NaI-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂, где два остатка Cys связаны дисульфидной связью, N-гидроксиэтилпиперазинил-ацетил-D-Рhe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, где два остатка Cys связаны дисульфидной связью, и N-гидроксиэтилпиперазинил-этил-cyльфoнил-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, где два остатка Cys связаны дисульфидной связью, или его фармацевтически приемлемая соль.

Еще в одном аспекте настоящее изобретение относится к ацилированному или алкилированному абсорбируемому полисахариду, имеющему одну или более концевых монофосфатных функциональных групп на молекулу. Предпочтительный вариант осуществления непосредственно вышеупомянутого представляет такой, где абсорбируемым полисахаридом является ацилированный γ-циклодекстрин. Дополнительный аспект вышеупомянутого касается конъюгата, включающего алкилированный или ацилированный абсорбируемый полисахарид с одной или более концевой монофосфатной функциональной группой в молекуле и пептид и/или биологически активное вещество, где пептид и биологически активное вещество имеют, по крайней мере, одну интерактивную аминогруппу, где монофосфатная функциональная группа образует связь с аминогруппой. Предпочтительным вариантом реализации непосредственно вышеупомянутого конъюгата является конъюгат, где пептид выбирается из группы, состоящей из р-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂, H-β-D-NaI-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂, где два остатка Сys связаны дисульфидной связью, N-гидроксиэтилпиперазинил-ацетил-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, где два остатка Cys связаны дисульфидной связью, и N-гидроксиэтилпиперазинил-этил-сульфонил-Рhe-Сys-Тyr-D-Trp-Lys-Abu-Сys-Thr-NH₂, где два остатка Сys связаны дисульфидной связью, или его фармацевтически приемлемая соль.

В еще одном аспекте настоящее изобретение относится к фармацевтической композиции, включающей один или более описанных здесь конъюгатов.

В дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к абсорбируемому полимеру с, по крайней мере, одной монофосфатной функциональной группой для использования в качестве кислотного наполнителя цианакрилатной композиции.

В другом дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения низкоплавкого, содержащего фосфорилированный гидроксил, сложного полиэфира с кристалличностью 1 - 60%, который заключается во взаимодействии гидроксилсодержащего сложного полиэфира с избытком пирофосфорной кислоты с целью получения содержащего фосфорилированный гидроксил сложного полиэфира.

Еще в другом дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения фосфорилированного-ацилированного циклодекстрина, который включает реакцию ацилированного циклодекстрина с избытком пирофосфорной кислоты для получения фосфорилированного-ацилированного циклодекстрина.

Еще в одном дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения фосфорилированного-алкилированного циклодекстрина, который включает взаимодействие алкилированного циклодекстрина с избытком пирофосфорной кислоты для приготовления фосфорилированного-алкилированного циклодекстрина.

В другом дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения фосфорилированных микрочастиц, включающему взаимодействие гидроксилсодержащей микрочастицы с избытком пирофосфорной кислоты для получения фосфорилированных микрочастиц.

В другом дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения ацилированного-фосфорилированного полисахарида, включающему взаимодействие полисахарида одновременно с нагретой смесью пирофосфорной кислоты и ацилирующего агента для приготовления ацилированного-фосфорилированного полисахарида. Предпочтительным для вышеупомянутого способа является такой, когда полисахаридом является циклодекстрин и ацилирующим веществом является пропионовый ангидрид или уксусный ангидрид. Реакция может быть проведена при температуре примерно от комнатной до 100^oС.

Еще в одном дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к фосфорилированному-привитому-ацилированному циклодекстрину, имеющему одну или более монофосфатную функциональную группу.

В другом дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к способу получения фосфорилированного-привитого-ацилированного циклодекстрина, который был привит с помощью гетероциклического мономера, включая используемые для получения абсорбируемых полимеров, например лактид, гликолид, триметиленкарбонат и/или ε-капролактон, этот способ включает нагревание мономера с ацилированным циклодекстрином в присутствии каталитического количества октановокислого олова(2) в течение 2-24 ч при температуре примерно 100 - 200^oС с образованием реакционной смеси, состоящей из привитого-ацилированного циклодекстрина; растворение реакционной смеси, состоящей из привитого-ацилированного циклодекстрина, в ацетоне для получения ацетонового раствора; осаждение ацетонового раствора в воде со льдом с образованием осадка; выделение осадка; сушку осадка для получения высушенного осадка и взаимодействие высушенного осадка с избытком пирофосфорной кислоты для получения фосфорилированного-привитого-ацилированного циклодекстрина.

В еще одном дополнительном аспекте настоящее изобретение относится к конъюгату, включающему пептид и/или биологически активное вещество и фосфорилированный-привитой-ацилированный циклодекстрин, где пептид и биологически активное вещество имеют, по крайней мере, одну интерактивную аминогруппу и монофосфатная группа образует связь с аминогруппой.

Термин "привитой" относится к привитому сложному полиэфиру, происходящему от гетероциклического мономера, как например лактид, гликолид, триметиленкарбонат и/или ε-капролактон.

Термин "абсорбируемый" означает, что нерастворимое в воде вещество, например полимер, подвергается в биологической среде диссоциации по цепи с превращением в водорастворимые побочные продукты, что является функцией времени, и почти не оставляет никакого остатка в месте имплантирования или введения.

В рассматриваемой заявке для обозначения аминокислоты используют стандартные трехбуквенные сокращения, известные в этой области, например А1а означает аланин.

Термин "микрочастица", используемый здесь, относится к частицам абсорбируемого сложного полиэфира, которые, в основном, сферической формы.

Термин "монофосфатная функциональная группа" означает, что полимерная цепь ковалентно соединяется с фосфорной кислотой простой фосфатной связью, оставляя две дополнительные кислотные группы -ОН доступными для конъюгации или нейтрализации, как изображается следующей структурой: сложный поли-эфир-chr-O-P(О)(ОН)₂, где R означает, например, Н или СН₃.

Подразумевают, что термин "пептид" включает пептиды, полипептиды и белки. Примеры пептидов включают, но не ограничиваются этим, пептид, высвобождающий гормон роста (GHRP), гормон, высвобождающий лютеинизирующий гормон (LHRH), соматостатин, бомбезин, пептид, высвобождающий гастрин (GRP), кальцитонин, брадикинин, галанин, меланоцитостимулирующий гормон (MSH), фактор, высвобождающий гормон роста (GRF), амилин, тахикинины, секретин, гормон околощитовидной железы (РТН), энцефалон, эндотелин, пептид, высвобождающий кальцитониновый ген (CRP), нейромедины, белок, родственный гормону околощитовидной железы (РТНrР), глюкагон, нейротензин, адренокортикотропный гормон (АСТН), пептид YY (PYY), пептид, высвобождающий глюкагон (GLP), вазоактивный кишечный пептид (VIP), пептид, активирующий гипофизарную аденилатциклазу (РАСАР), мотилин, вещество Р, нейропептид Y (NPY), тирео-стимулирующий гормон (TSH), гормон роста, эритропоэтин, фактор, стимулирующий колонии гранулоцитов, фактор, стимулирующий колонии гранулоцит-макрофаг, интерфероны, аналог LHRH p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂ (пептид А), аналог соматостатина H-β-D-NaI-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂, где два остатка Cys связаны дисульфидной связью (пептид В), N-гидроксиэтилпиперазинил-ацетил-D-Рhе-Сys-Тyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, где два остатка Cys связаны дисульфидной связью, или N-гидроксиэтилпиперазинил-этилсульфонил-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, где два остатка Cys связаны дисульфидной связью (пептид С), и аналоги и их фрагменты или их фармацевтически приемлемую соль.

Термин "биологически активное вещество" подразумевает любое химическое соединение, включая пептиды, которое может быть введено больному с лечебной или профилактической целью, и, таким образом, включает лекарственные препараты.

Термин "интерактивная аминогруппа" относится к аминогруппе, которая способна к химическому взаимодействию с другой химической функциональной группой, как например гидроксильная группа монофосфатного остатка.

Термин "связи" относится к химическим связям, которые по природе могут быть ионными и/или ковалентными, между названными структурными элементами.

Фраза "концевая монофосфатная функциональная группа в цепи абсорбируемого сложного полиэфира" указывает, что любой конец полиэфирной цепи может иметь монофосфатную функциональную группу.

Члены семейства монофосфатов сложных полиэфиров, которые способны смешиваться в цианакрилатных сложных эфирах, могут быть использованы в качестве кислотного наполнителя в абсорбируемых тканеадгезивных композициях, включающих алкоксиалкиловые цианакрилаты. Кислотная функциональная группа этих сложных полиэфиров может стабилизировать цианакрилат в присутствии следов загрязнений окружающей среды, которые являются основными по природе.

Термин "низкоплавкий сложный полиэфир" означает, что сложный полиэфир плавится в диапазоне температур примерно 25 - 120^oС.

Термин "кристалличность" относится к фракции твердого вещества, которая характеризуется трехмерным порядком, который поддерживается до тех пор, пока вещество нагревается до температуры, при или выше температуры плавления, где вещество превращается в жидкость.

Настоящее изобретение относится к монофосфатным аналогам некоторых типов гидроксильных олигомеров и полимеров, которые могут быть жидкостями, твердыми аморфными веществами или кристаллическими веществами при комнатной температуре. Свободная функциональная группа -Р(О)(ОН)₂ фосфорилированных производных олигомерных и полимерных систем способна к конъюгированию с образованием ионных и/или ковалентных связей с основными аминогруппами биологически активных веществ, включая пептиды и белки. Фосфорилирование может быть проведено с расплавленным сложным полиэфиром или с твердыми сложными полиэфирами в виде микрочастиц и с предварительно модифицированными или in situ модифицированными полисахаридами, как например частично ацилированные циклодекстрины. Фосфорилированные субстраты по изобретению используются для образования новых ионных конъюгатов с аминокислотами, полипептидами и белками или с любым органическим соединением, которое имеет, по крайней мере, одну доступную интерактивную аминогруппу.

Гидроксилсодержащие олигомеры и полимеры, являющиеся объектом данного изобретения, включают сложные полиэфиры с концевыми гидроксильными группами (НТРЕ) и ацилированные или алкилированные циклодекстрины. Сложные полиэфиры (НТРЕ) могут быть получены с помощью полимеризации с раскрытием колец лактонов (как, например, гликолид, лактид, ε-капролактон, р-диоксанон) и/или циклического карбоната (как, например, триметиленкарбонат) в присутствии неорганического или металлорганического катализатора (как, например, октановокислое олово(2)) и содержащего гидроксил инициатора (как, например, 1,6-гександиол, 1,3-пропандиол и диэтиленгликоль) в условиях, которые обычно используют в этой области для полимеризации с раскрытием кольца (см. Shalaby, S. W., et al., "Absorbable Polyesters" в Biomedical Polymers Designed to Degrade, глава 1, Shalaby, S.W. Ed. Hansen Publ., NY 1994). Получающиеся в результате сложные полиэфиры, сополимеры сложных эфиров или сополимеры сложных эфиров с карбонатами могут быть в виде жидкости, аморфного вещества или высоко кристаллических веществ, содержащих не менее одной гидроксильной группы в цепи полимера. Высоко кристаллические твердые вещества сложных полиэфиров данного изобретения могут быть уменьшены в размере для образования микрочастиц, имеющих средний диаметр 0,1 - 100,0 мкм. Другие содержащие гидроксил олигомеры и полимеры включают производные олигосахаридов, как например ацилированные или алкилированные циклодекстрины, имеющие, по крайней мере, одну гидроксильную группу в молекуле. Эти производные могут быть профосфорилированы непосредственно или привиты к сложному полиэфиру, сополимеру сложного эфира или к цепям сополимеров сложного эфира и карбоната, таким, как описаны выше для сложных полиэфиров с концевыми гидроксильными группами.

Превращение гидроксилсодержащих олигомеров и полимеров описанных здесь типов достигается путем фосфорилирования их гидроксильных групп, используя реакционноспособные производные фосфорной кислоты, как например пирофосфорная кислота. Используются стехиометрические или избыточные количества фосфорилирующего средства. Реакцию проводят с или без инертного растворителя и при температуре в интервале примерно 10 - 150^oС в течение периода времени от нескольких минут до нескольких часов в зависимости от химического строения реагирующего субстрата. По завершении реакции продукт фракционируют для удаления избытка реагента и побочных продуктов. При использовании пирофосфорной кислоты полученную в результате реакционную смесь растворяют в смешивающемся с водой растворителе, как например ацетон. Ацетоновый раствор затем прибавляют к перемешиваемой воде со льдом. После этого твердый фосфорилированный продукт выделяют при центрифугировании или фильтрации. После тщательной промывки продукта его сушат при пониженном давлении. Когда используются кристаллические, превращенные в микрочастицы субстраты с гидроксильными группами, условия реакции могут быть установлены так, чтобы обеспечить микрочастицам их первоначальные размеры после того, как они будут профосфорилированы. Реакцию микрочастиц можно проводить с использованием или без использования жидкой инертной органической среды. Пирофосфорная кислота является типичным примером реакционноспособных кислотных производных, которые могут быть использованы для включения функциональной группы -О-Р(О)(ОН)₂ в гидроксилсодержащий субстрат. Примеры других фосфорилирующих средств, которые могут быть использованы в настоящем изобретении, включают метилмонофосфат, этилмонофосфат и фенилмонофосфат.

Для образования конъюгатов различных монофосфатов полимера отдельный монофосфат полимера растворяют или суспендируют в подходящей среде "А", как например вода или смесь воды и ацетонитрила, и подвергают взаимодействию с основным биологически активным веществом, присутствующим в водном растворе, смешиваемом в "А". В зависимости от химических свойств биологически активного вещества может потребоваться основной неорганический реагент, чтобы биологически активное вещество присутствовало в виде свободного основания. В случае соли пептида, как например ацетат пептида, может быть использовано неорганическое основание, как например бикарбонат натрия, чтобы удалить ацетатные ионы от пептида и позволить свободному основанию последнего конъюгироваться с образованием ионных и/или ковалентных связей с монофосфатной группой олигомерных или полимерных субстратов.

Микрочастица по настоящему изобретению готовится при измельчении полимера до микронных размеров путем первоначального измельчения с использованием ножа для измельчения. Полимер затем измельчают до микронных размеров в микронной коллоидной мельнице Aljet, используя подаваемый под повышенным давлением поток сухого азота. Средняя величина диаметра частицы анализируется в эталонном классификаторе/Е Малверна с использованием модели распределения по объему и силиконового масла 200/5 сS в качестве диспергирующего вещества.

Микрочастицы конъюгата по данному изобретению могут быть введены больному путями, хорошо известными обычному специалисту в данной области, как например парентеральное введение, пероральное введение или местное введение. Предпочтительно вводится в виде порошка или суспензии через нос или в виде лекарственной формы для ингаляции через легочную систему. Когда введение парентеральное, предпочтительно осуществляют введение в виде дисперсии в изотонической водной среде или неводной абсорбируемого гелеобразующего жидкого сложного полиэфира, как описано в патенте США 5612052, на содержание которого здесь ссылаются. Готовые лекарственные формы, включающие микрочастицы конъюгата по настоящему изобретению, могут также включать множество необязательных компонентов. Такие компоненты включают, но не ограничиваются этим, поверхностно-активные вещества, регулирующие вязкость средства, лекарственные средства, модуляторы роста клеток, красители, комплексообразователи, антиоксиданты, другие полимеры, как например карбоксиметилцеллюлоза, смолы, например кизельгур, воски/масла, как например касторовое масло, глицерин, дибутилфталат и ди(2-этилгексил)фталат и им подобные. В случае применения такие необязательные компоненты составляют примерно от 0,1 до 20%, предпочтительно примерно от 0,5 до 5%, от общей лекарственной формы.

Эффективные дозировки микрочастиц конъюгата по настоящему изобретению, которые вводятся больному, могут быть определены лечащим врачом или ветеринаром и будут зависеть от соответствующих доз, рассматриваемых для пептида и/или биологически активного вещества, конъюгированных в микрочастицах. Такие дозировки либо известны, либо могут быть определены обычным специалистом в этой области.

Раскрытие каждого из цитируемых здесь документов включено в виде ссылки.

Следующие примеры приведены с целью иллюстрации и обучения и не предполагают ограничения рамок настоящего изобретения.

Пример 1. Получение сложного полиэфира с концевой гидроксильной группой: CEG-1 получали из капролактона (137,3 г, 1,204 моль) и диэтиленгликоля (12,7 г, 0,12 моль), используя октановокислое олово(2) (Sigma Chemical Co., St.Louis, МО) в качестве катализатора, при мольном отношении мономер/катализатор 5000:1 (1,3 мл 0,2М раствора толуола). Колбу загружали и укомплектовывали механической мешалкой. Реагенты нагревали в течение примерно 12 часов при температуре около 150^oС в атмосфере сухого аргона. Полимер выделяли и очищали путем осаждения ацетонового раствора реакционной смеси в воде со льдом. Полученный в результате полимер выделяли, сушили и затем анализировали для установления состава, молекулярной массы и термических свойств, используя ИК-спектроскопию, ЯМР-спектроскопию, гель-проникающую хроматографию (ГПХ) и дифференциальную сканирующую калориметрию (ДСК) соответственно. Непрореагировавший мономер отгоняли при пониженном давлении при температуре около 120^oС.

При замене диэтиленгликоля 1,3-пропандиолом при различных соотношениях мономер/инициатор был получен, согласно описанной в примере 1 методике, ряд полимеров с концевыми гидроксильными группами с молекулярными массами в некотором диапазоне. Это CPD-1 и CPD-2 на основе ε-капролактона и 1,3-пропандиола.

Используя смесь 70/30 1-лактид/гликолид, 85/15 dl-лактид/гликолид, 70/30 1-лактид/гликолид или 80/20 1-лактид/d1-лактид, были получены, в основном, согласно описанной в примере 1 методике в таких же условиях реакции и при различных количествах 1,3-пропандиола для достижения желаемых среднечисленных молекулярных масс (Mn) в диапазоне от 2 до 20 кДа, соответствующие сополимеры, обозначенные PDLG-L PDLG-2, PD-100 и PD-101, соответственно.

Пример 2. Получение фосфорилированных сложных полиэфиров: CEG-l-Phos-5 был получен из CEG-1 (из примера 1) и пирофосфорной кислоты без использования растворителя при мольном соотношении 4:1 пирофосфорной кислоты (1,3 г) и CEG-1 (5,0 г). Вышеупомянутую реакционную смесь подвергали реакции в течение примерно 80 минут при комнатной температуре. Полученный в результате продукт растворяли в 30 мл ацетона и осаждали в воде со льдом. Полимер выделяли и сушили при пониженном давлении и затем анализировали, как описано в примере 1. Дополнительно с помощью элементного анализа определяли содержание трехвалентного фосфора. Эквивалентная масса фосфорилированного продукта была определена путем ацидиметрии.

Следуя вышеуказанной методике для получения CEG-1-Phos-5, были приготовлены две другие партии фосфорилированного CEG-1, а именно, CEG-l-Phos-6 и CEG-l-Phos-7. Подобным образом, CPD-2 фосфорилировали и получали CPD-2-Phos-l и сополимеры, PLDG-1, PDLG-2, PD-100 и PD-101, для приготовления PLDG-l-Phos-1, PDLG-2-Phos-l, PD-100-Phos-l и PD-101-Phos-l, соответственно, все соединения получали, в основном, согласно методике получения CEG-l-Phos-5.

Пример 3. Получение фосфорилированных конъюгатов сложный полиэфир/полипептид: CON-P3 получали из пептида А и CEG-l-Phos-5A (другая партия CEG-l-Phos-5). Так, CEG-l-Phos-5A (0,9974 г) растворяли в 10 мл ацетонитрила. Этот раствор фильтровали через шприцевый фильтр для удаления следов нерастворимых частиц полимера. Пептид А (199 мг) растворяли в 2 мл воды. Основываясь на содержании ацетата пептида А, прибавляли 25 мг карбоната натрия к раствору полимера в ацетонитриле для обмена с ацетатом в пептиде. Затем прибавляли по каплям раствор пептида А к раствору полимера. После прибавления всего раствора пептида примерно в течение десятиминутного интервала полученный раствор перемешивали около 0,5 часа. Раствор затем осаждали в соленую воду со льдом и центрифугировали, чтобы собрать продукт. Последний промывали дистиллированной водой и повторно центрифугировали. Продукт сушили в вакууме. Полученный в результате конъюгат анализировали на содержание в нем пептида, используя элементный анализ для определения азота.

Следуя той же методике, как описано для примера 3, были получены конъюгаты, представленные в табл. I, из указанных отдельных пептидов и фосфорилированных сложных полиэфиров в указанных соотношениях и средах для осаждения (ОС, вода или изопропиловый спирт).

Пример 4. Получение кристаллических микрочастиц полигликолида с концевыми гидроксильными группами: PDGLY-1 получали в виде твердого кристаллического вещества, используя мольное отношение гликолида к 1,3-пропандиолу около 25:1. Гликолид (200 г, 1,724 моль) плавили в высушенной над пламенем колбе под аргоном и прибавляли 1,3-пропандиол (5,249 г, 69,1 ммоль). В колбу, содержащую расплавленные реагенты, помещали октановокислое олово (2) (0,575 мл 0,2М раствора в толуоле) и поднимали температуру примерно до 160^oС. После приблизительно 30 минут полимеризация была завершена и температуру понижали до примерно 110^oС. Непрореагировавший мономер удаляли путем отгонки при пониженном давлении примерно при 120^oС. Продукт затем размалывали и измельчали до микронных размеров, как описано выше.

Подобным же образом, как изложено в методике примера 4, получали PD-102 из смеси 15/1 гликолида и 2,3-пропандиола.

Пример 5. Получение фосфорилированных по поверхности полигликолидных микрочастиц: PDGLY-l-Phos-2 получали при плавлении 9,7 г пирофосфорной кислоты при температуре около 60^oС и прибавлении при перемешивании в атмосфере сухого аргона 4,4 г PDGLY-1. Реакцию продолжали около трех часов при такой же температуре. Продукт охлаждали до примерно 10^oС и затем смешивали с 20 мл холодной воды. Смесь подвергали действию ультразвука около 5 минут, трижды промывали водой и затем сушили при пониженном давлении. Продукт анализировали на содержание трехвалентного фосфора и Т. пл. (температура плавления), применяя элементный анализ и ДСК, соответственно.

Аналогичным способом PD-102 превращали в PD102-Phos-l, в основном в соответствии с методикой приготовления PDGLY-l-Phos-2.

Пример 6. Получение типичных полипептидных конъюгатов при использовании фосфорилированных полигликолидных микрочастиц: PICP3 получали из PDGLYl-Phos-2 и пептида В (50 мг), растворенных в 2 мл смеси 50:50 ацетонитрил/вода. В качестве контрольного образца отбирали аликвотную пробу пептидного раствора в 20 мкл. Прибавляли PDGLYl-Phos-2 (502 мг) в пузырек, содержащий оставшийся раствор пептида, и обрабатывали ультразвуком около 5 мин и затем перемешивали около 2 ч. Продукт выделяли путем центрифугирования и затем сушили при пониженном давлении. Надосадочную жидкость анализировали с помощью ВЭЖХ для определения связавшегося с порошком количества пептида. Результаты ВЭЖХ показывали, что связывалось 6,7% пептида по массе. Содержание пептида составило 7,2% по данным элементного анализа на азот.

Аналогично вышеописанной методике PD-102-Phos-l подвергали конъюгации с пептидом В для получения PICP-4.

Пример 7. Получение карбоксилированного по эндо-цепи поли(d1-лактид-со-гликолид) 85/15 (TR-100): Смесь (85/15, молярное соотношение) dl-лактида и гликолида подвергали полимеризации, следуя, в основном, той же методике, которая описана в примере 1, но используя L-винную кислоту в качестве инициатора (при молярном соотношении лактон/винная кислота 50/1) и октановокислое олово (2) в качестве катализатора (при отношении мономера к катализатору 5000/1).

Пример 8. Фосфорилирование TR-100 для получения TR101-Phos2: Фосфорилирование проводили, как описано в примере 2, используя смесь TR-100 (15 г) и пирофосфорной кислоты (1,244 г).

Пример 9. Ионная конъюгация TR100-Phos1 для получения CON-P9, CON-P12 и CON-P15: Используя ту же методику, что описана в примере 3, пептид В (373 мг) подвергали реакции с 1,5 г TR100-Phos1 для получения CON-P9. Подобным образом CON-P12 был получен при использовании пептида А (400 мг) и TR100-Phos1 (2,5 г). При получении CON-P15 в качестве среды для осаждения был использован холодный 2-пропанол, получали конъюгат на основе пептида В (400 мг) и TR100-Phos1 (2,5 г).

Пример 10. Получение фосфорилированного производного γ-циклодекстрина (GCD-Phos3):
Аликвотную пробу γ-циклодекстрина (20,0 г) смешивали в предварительно высушенной колбе с 46,23 г пропионового ангидрида и 16,46 г пирофосфорной кислоты в атмосфере сухого азота. Реагенты нагревали примерно при 45^oС, перемешивая около 0,5 часа. Смесь охлаждали и затем осаждали в дистиллированную воду со льдом. Продукт выделяли и затем сушили при пониженном давлении. Анализ показал, что вещество содержит 0,43% трехвалентного фосфора по массе и имеет эквивалентную массу (ЭМ) 1251.

Пример 11. Получение типичного полипептидного конъюгата фосфорилированного производного γ-циклодекстрина:
Типичное производное, как например GCD-Phos3 (1,7 г), подвергали конъюгации с пептидом (например, пептид В, 300 мг), как описано для получения конъюгата в примере 3, получая CONG-Р100.

Пример 12. Получение тканеадгезивной композиции:
Фосфорилированный полиэфир из примера 2 (0,5 г) растворяли в метоксипропиловом эфире цианакриловой кислоты (9,5 г) и полученную в результате жидкую композицию хранили при комнатной температуре в необработанном (не промытом кислотой) стеклянном пузырьке в течение нескольких дней, при этом не обнаруживали никаких признаков полимеризации (на что указывало отсутствие видимого изменения вязкости). Нанесение такой тканеадгезивной композиции на влажную козлиную шкуру приводило примерно за 1 мин к образованию податливой (эластичной), сцепляющейся с тканью пленки.

Формула изобретения

1. Абсорбируемый сложный полиэфир с по крайней мере одной монофосфатной функциональной группой в цепи абсорбируемого сложного полиэфира, где цепь сложного полиэфира включает один или более мономеров, выбранных из группы, состоящей из L-молочной кислоты, D-молочной кислоты, DL-молочной кислоты, яблочной кислоты, лимонной кислоты, винной кислоты, ε-капроновой кислоты, алкиленоксалата, циклоалкиленоксалата, алкиленсукцината, β-гидроксибутирата, гликолида, гликолевой кислоты, L-лактида, D-лактида, DL-лактида, мезолактида, триметиленкарбоната, p-диоксанона, 1,5-диоксепан-2-она и 1,4-диоксепан-2-она и любых их оптически активных изомеров, рацематов или их сополимеров.

2. Абсорбируемый сложный полиэфир по п.1, дополнительно включающий один или более сегментов полиэтиленгликоля, ковалентно связанных с указанным сложным полиэфиром.

3. Абсорбируемый полимер по п.1 для использования в качестве кислотного наполнителя цианакрилатной композиции.

4. Конъюгат, включающий абсорбируемый сложный полиэфир по п.1 и пептид и/или биологически активное вещество, выбираемое из группы, состоящей из p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂, H-β-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂, где два остатка Cys связаны дисульфидной связью, N-гидроксиэтилпиперазинил-ацетил-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, где два остатка Cys связаны дисульфидной связью, и N-гидроксиэтилпиперазинил-этилсульфонил-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, где два остатка Cys связаны дисульфидной связью, или их фармацевтически приемлемой соли, где пептид и биологически активное вещество имеют по крайней мере одну интерактивную аминогруппу, где монофосфатная функциональная группа образует связь с аминогруппой.

5. Твердая абсорбируемая микрочастица, включающая абсорбируемый сложный полиэфир по п.1 и имеющая поверхность, где на поверхности абсорбируемой микрочастицы находится более 1% монофосфатных функциональных групп, и имеющая в основном сферическую форму.

6. Конъюгат, включающий абсорбируемую микрочастицу по п.5 и пептид и/или биологически активное вещество, где пептид и биологически активное вещество имеют по крайней мере одну интерактивную аминогруппу, где монофосфатная функциональная группа на поверхности абсорбируемой микрочастицы образует связь с аминогруппой.

7. Конъюгат по п.6, где пептид выбирается из группы, состоящей из p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂, H-β-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂, где два остатка Cys связаны дисульфидной связью, N-гидроксиэтилпиперазинил-ацетил-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, где два остатка Cys связаны дисульфидной связью, и N-гидроксиэтилпиперазинил-этилсульфонил-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, где два остатка Cys связаны дисульфидной связью, или их фармацевтически приемлемой соли.

8. Ацилированный или алкилированный абсорбируемый полисахарид, имеющий одну или более концевых монофосфатных функциональных групп на молекулу.

9. Ацилированный или алкилированный абсорбируемый полисахарид по п.8, где упомянутый абсорбируемый полисахарид является ацилированным γ-циклодекстрином.

10. Конъюгат, включающий алкилированный или ацилированный абсорбируемый γ-циклодекстрин и пептид и/или биологически активное вещество, где пептид и биологически активное вещество имеют по крайней мере одну интерактивную аминогруппу, где монофосфатная функциональная группа образует связь с аминогруппой.

11. Конъюгат по п.10, где пептид и/или биологически активное вещество выбираются из группы, состоящей из p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂, H-β-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂, где два остатка Cys связаны дисульфидной связью, N-гидроксиэтилпиперазинил-ацетил-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, где два остатка Cys связаны дисульфидной связью, и N-гидроксиэтилпиперазинил-этилсульфонил-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, где два остатка Cys связаны дисульфидной связью, или их фармацевтически приемлемой соли.

12. Конъюгат, включающий абсорбируемый сложный полиэфир по п.2 и пептид и/или биологически активное вещество, где пептид и биологически активное вещество имеют по крайней мере одну интерактивную аминогруппу, где монофосфатная функциональная группа образует связь с аминогруппой.

13. Конъюгат по п.12, где пептид и/или биологически активное вещество выбирается из группы, состоящей из p-Glu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Trp-Leu-Arg-Pro-Gly-NH₂, H-β-D-Nal-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Val-Cys-Thr-NH₂, где два остатка Cys связаны дисульфидной связью, N-гидроксиэтилпиперазинил-ацетил-D-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, где два остатка Cys связаны дисульфидной связью, и N-гидроксиэтилпиперазинил-этилсульфонил-Phe-Cys-Tyr-D-Trp-Lys-Abu-Cys-Thr-NH₂, где два остатка Cys связаны дисульфидной связью, или их фармацевтически приемлемой соли.

14. Фармацевтическая композиция, способная к замедленному высвобождению биоактивного пептида, включающая конъюгат по п.4 и фармацевтически приемлемый носитель.

15. Фармацевтическая композиция, способная к замедленному высвобождению биоактивного пептида, включающая конъюгат по п.6 и фармацевтически приемлемый носитель.

16. Фармацевтическая композиция, способная к замедленному высвобождению биоактивного пептида, включающая конъюгат по п.10 и фармацевтически приемлемый носитель.

17. Фармацевтическая композиция, способная к замедленному высвобождению биоактивного пептида, включающая конъюгат по п.12 и фармацевтически приемлемый носитель.

18. Способ получения низкоплавкого фосфорилированного сложного полиэфира с гидроксильными группами с кристалличностью 1-60%, который включает взаимодействие гидроксилсодержащего сложного полиэфира с избытком пирофосфорной кислоты с получением фосфорилированного сложного полиэфира с гидроксильными группами.

19. Способ получения фосфорилированного-ацилированного циклодекстрина, который включает взаимодействие ацилированного циклодекстрина с избытком пирофосфорной кислоты с получением фосфорилированного-ацилированного циклодекстрина.

20. Способ получения фосфорилированного-алкилированного циклодекстрина, который включает взаимодействие алкилированного циклодекстрина с избытком пирофосфорной кислоты с получением фосфорилированного-алкилированного циклодекстрина.

21. Способ получения фосфорилированных микрочастиц, который включает взаимодействие гидроксилсодержащей микрочастицы с избытком пирофосфорной кислоты с получением фосфорилированных микрочастиц.

22. Способ получения ацилированного-фосфорилированного полисахарида, который включает взаимодействие полисахарида одновременно с нагретой смесью пирофосфорной кислоты и ацилирующим средством с получением ацилированного-фосфорилированного полисахарида.

23. Способ по п.22, где полисахаридом является циклодекстрин и ацилирующим средством является пропионовый ангидрид или уксусный ангидрид.

24. Фосфорилированный-привитой-ацилированный циклодекстрин, имеющий одну или более монофосфатных функциональных групп.

25. Способ получения фосфорилированного-привитого-ацилированного циклодекстрина, который включает нагревание мономера с ацилированным циклодекстрином в присутствии каталитического количества октановокислого олова (2) примерно в течение 2-24 ч при температуре примерно 100-200^oC с образованием реакционной смеси, состоящей из привитого-ацилированного циклодекстрина; растворение реакционной смеси в ацетоне для получения ацетонового раствора; осаждение ацетонового раствора в воде со льдом для образования осадка; выделение осадка; сушку осадка с получением высушенного осадка и реакцию высушенного осадка с избытком пирофосфорной кислоты с получением фосфорилированного-привитого-ацилированного циклодекстрина.

26. Конъюгат, включающий фосфорилированный-привитой-ацилированный циклодекстрин и пептид и/или биологически активное вещество, где пептид и биологически активное вещество имеют по крайней мере одну интерактивную аминогруппу и монофосфатная группа образует связь с аминогруппой.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5